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imaging (Subject) / Ogris 1 (Lesson)
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- Sehfeldzahl? Sehfeldzahl: Durchmesser (mm) der Sehfeldblende inder Zwischenbildebene (in mm)
- ab wann ist eine Wurzel polyarch 6 Strahlen
- Mikroskop Bauteile: Aperturblende Zur Erinnerung:NA = 2*n*sin α Öffnungsgrad der Aperturblende bestimmt die Numerische Apertur:
- Kondensor und Aperturblende: Auflösung, Kontrast und Tiefenschärfe? Irisblende fast geschlossen-> optische Artefakte!Irisblende ganz offen-> Bild erscheint kontrastarm Irisblende zum Teilgeöffnet -> Optimum Iris blende = Aperture Blende
- Optimale Kondensorapertur Aperturblende zu ca 80% geöffnet (siehe reelles Bild derAperturblende in der hinteren Brennebene des Objektivs (Sichtbar nach Entfernen desOkulars und Blick in den Tubus)
- kleiner Aperture blende = ? größere Tiefenschärfe -> dreck sichtbar
- Köhlersche Beleuchtung Problem:Falschlicht z.B. durch Streuung von Licht an• Objekten außerhalb des Sehfeldes• Reflexion an Systemkomponenten(Staub am Kondensor, etc), etc (Hypothetische) Problemlösung :Blende, damit nur Präparatausschnittbeleuchtet istNachteil: PraktischeDurchführbarkeit(Praktische) Problemlösung:Bild einer Blende (Leuchtfeldblende)in der Präparatebene abbilden! Voraussetzungen: • Beleuchtung mit Kollektorlinse• Leuchtfeldblende• Kondensor (höhenverstell- und zentrierbar)• Aperturblende (verstellbar)Durchführung1. Kondensor in oberste Position (nahe zumPräparat)2. Präparat einlegen und fokussieren3. Leuchtfeldblende schließen4. Kondensorabstand variieren, bisLeuchtfeldblende scharf abgebildet wird(Lukenstrahlengang)5. Kondensor zentrieren, bis Leuchtfeldblendemittig erscheint6. Leuchtfeldblende öffnen, bis Bild (gerade)komplett ausgeleuchtet ist
- Kontrast: Intensitäts- oder Helligkeits-Verhältnis von zwei Bereichen eines Bildes,zum Beispiel der Helligkeitsunterschied zwischen der aufgelösten Struktur und demHintergrund. • Heller Hintergrund: Starke Intensitätssteigerung der Struktur notwendig• Dunkler Hintergrund: Geringe Intensitätssteigerung der Struktur bereits sichtbar• Auch bei optimaler Auflösung ist entsprechender Kontrast notwendig
- Doppelbrechung • Doppelbrechung: Kristalle weisen Anisotropie auf (vgl Glas: isotrop, daerstarrte Schmelze) Optische Achse eines Kristalls:• Lichtgeschwindigkeit für Lichtwellenaller Polarisationsrichtungen gleich Eintrittsstrahl nichtparallel zu opt. Kristallachse:• Lichtstrahl wird in zwei Polarisationskomponenten aufgespalten• Unterschiedliche Geschwindigkeit (und Brechungsindices) Phasenunterschied beim Austritt Interferenz Doppelbrechende Strukturen• Eigendoppelbrechung: Anisotrope Kristalle (Oxalat, kristallisierte Proteine,Glukosekristalle, etc (nicht Steinsalz (warum?))• Formdoppelbrechung: Gleichmäßig angeordnete Nanostrukturen mir regelmäßigerStruktur (z.B. kristalline Bereiche in Stärke (Amylopektin) vs amorphe Stärke
- FL Filtertypen: Short-pass Short-pass:Lässt Licht unter einer abgegebenen Wellenlänge durch
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- FL Filtertypen: Long-pass Long-pass:Lässt Licht über einer abgegebenen Wellenlänge durch
- FL Filtertypen: Band-pass Bandpass:Lässt Licht innerhalb eines abgegebenen Wellenlängenbereichs durch
- FL Filtertypen: Dichroic Dichroitischer Spiegel (Dichroic mirror, kurz: dichroic):Reflektiert Licht unterhalb einer abgegebenen Wellenlänge und ist durchlässig überdiesem Wert
- Emission von Lichtquanten durch (bio)chemische Reaktionen • ATP unabhängige Luciferasen: Gaussia Princeps Renilla Reniformis Aequorea Victoria Coelenterazine -> Coelenteramide
- Emission von Lichtquanten durch (bio)chemische Reaktionen • ATP abhängige Luciferasen: Luciola Italica Lampyris noctiluca Photinus Pyralis Luciferin umwandlung
- Biolumineszenz: Enzymkinetik Gaussia, Renilla: Maximale Enzymaktivität in wenigen Sekunden erreicht, -> anschl.rascher Signalabfall Firefly: Maximum wird erst nach einigen Sekunden erreicht, anschl. länger anhaltendeAktivitä
- GFP: Aufbau und Funktionsweise • Beta-barrel (Beta-Fass)• Hexapeptid (Chromophor)• Proteinstruktur schützt Chromophor (pH, Denaturierung, ∆T) Hexapeptid im inneren der Fass-Struktur bildet ein delokalisiertes πElektronensystem, absorbiert blaues Licht (Aequorin!) und emittiert grün:
- Taxol: Wirkmechanismus Taxol bindet anstelle von GTP an β-Tubulin→ MT wird stabilisiert, kein Zerfall→ verringerte Konzentration an freiem Tubulin→ Zellen bleiben in G2/M Phase ‚stecken‘ (vgl. Durchflußzytometrie!)→ Zellteilung wird inhibiert→ Apoptose
- Egr1-Luc Maus • Early-Growth-Response-1:• Bedeutender Wachstumsfaktor• Enbryonalentwicklung• Gefäßwachstum• Krebs• In vitro Studien spiegeln nicht die komplexe in vivo Situation wider Generierung einer Reporter-Mauslinie, die Luciferase unter Kontrolle desEGR-1 Promoters exprimiert Krebs mit luciferase Reporter gen wird implantiert und luciferin injeziert, die maus begint lokal zu leuchten
- Brainbow Technologie • Expression unterschiedlicher fluoreszierende Proteine (CFP, YFP, RFP, inNeuronen (mit neuen Versionen auch in anderen Zellen, z.B. Muskel-, etc)• Unspr. für Maus Neuronen, mittlerweile auch für andere Gewebe undOrganismen, z.B. Fruchtfliege (Drosophila Melanogaster), und anderenFarben/Proteinen• (Gruppen von) Zellen fluoreszieren mit unterschiedlichen Farben (Genefür FL Proteine werden unabhängig voneinander in das Zellgenomeingebaut)Anwendung (Auswahl):• Identifikation vonSynapsenschaltungen• Räumliche und zeitliche Verfolgungeinzelner Körperzellen und derenAusbreitung in der(Embryonal)Entwicklung
- In vivo Imaging: Biolumineszenz vs Fluoreszenz Biolumineszenz• Rekombinante Proteine• Substrat notwendig• Sehr gutes Signal/RauschVerhältnis• Messzeit limitiert durchEnzymkinetikFluoreszenz• Farbstoffe oder rek. Proteine• Kein Substrat• Hintergrundsignal (Auto-FL, etc)• Gute räumliche Auflösung (Auch fürhistolog. Schnitte geeignet• Anregungs- und Emissionslicht durchGewebe abgeschwächt• Alternative: Nahe-Infrarot-Imaging
- CLSM: Rauschreduktion Gründe für Hintergrundrauschen: • Verstärkerspannung zu hoch• Wärme (setzt e- im Detektor frei)• ‚Schrotrauschen‘ (Photonenemission ist statistisch verteilt)• Streulicht