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Arzneistoffanalytik (Subject) / NMR (Lesson)

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• Ab wann besitzt ein Atomkern ein magnetisches Moment OZ I MZ ug, gu, uu - Kerne: Spinquantenzahl I > 0 (1/2, 1, 3/2, 2, ...), besitzen magnetisches Moment μ Bsp. 1H-NMR gg-Kerne: Spinquantenzahl I = 0, kein magnetisches Moment μ, dem NMR-Experiment nicht zugänglich! → z.B. 12C, 16O !
• Was passiert wenn man ein Magnetfeld bei Atomen mit magnetischem Moment anlegt? beim Anlegen eines äußeren Magnetfeldes B0 ergeben sich 2 Einstellmöglichkeiten: 1. in Richtung von B0 (energetisch günstiger) 2. gegen die Richtung von B0 (energetisch etwas ungünstiger)
• Warum muss das Magnetfeld eines NMR´s möglichst stark sein? • je größer B0, desto größer die Energiedifferenz zwischenα und β Niveau → möglichst starkes Magnetfeld!!!!• je tiefer die Temperatur, desto größer ∆E (wenig Spielraum!)
• Larmor Gleichung Gibt die bedinung an für Resonanz ΔE=Y*(h/2π)*B0 γ = magnetogyrisches (gyromagnetisches) Verhältnis (Naturkonstante welche die Empfindlichkeit eines Kernes für das NMR-Experiment beschreibt)ν = Resonanzfrequenz (60-900 MHz bei NMR-Geräten)ω = Kreisfrequenz der Präzessionsbewegung, Larmorfrequenz
• continous wave (CW) Technik NMR Aufbau und Funktion die einzelnen Resonanzen werden nacheinander durch kontinuier- liche Veränderung von ν (Frequenz-sweep) oder B0 (Feld-sweep) unter Erfüllung der Resonanzbedingung ν = γ/2π•B0 erfaßt→ veraltet, langsam, unempfindlich (nur für empfindliche Kerne), keine modernen NMR-Experimente möglich Magnet Senderspule im rechten winkel zur Empfängerspule  Probe Shim und sweep Spule  A shim is a device used to adjust the homogeneity of a magnetic field. Shimming is a process that is carried out to correct any inhomogeneities in the applied magnetic field during a nuclear magnetic resonance (NMR) experiment. The inhomogeneities can come from two main sources: Variation in the applied field due to imperfections in the main magnet, or arising from the main magnetDeviations in the main magnetic field due to the presence of the sample and probe in the field)
• Puls-Fourier-Transform Technik (PFT) Aufbau und Funktion alle Resonanzen werden durch einen RF-Puls gleichzeitig angeregt das erhaltene Interferogramm (Überlagerung aller Abklingkurven = free induction decay - FID) wird durch eine mathematische Operation (Fourier-Transformation) in das NMR-Spektrum umgewandelt → schnell, empfindlich (Akkumlierung von FIDs üblich), besser bearbeitbar; moderne NMR-Spektroskopie verwendet 'Pulsfolgen' = Kombination von mehreren Pulsen verschiedener Richtung und Größe, getrennt durch genau definierte Zeitintervalle
• Verteilung der Kerne auf dem Doppelpräzessionskegel? Wegen Nα > Nβ resultiert eine makroskopische Gesamt-Magnetisierung (bulk) M0 in z-Richtung (Richtung des Magnetfeldes B0). Durch die statistische Verteilung in der xy-Ebene sind die Komponenten entlang der x- und y-Achse gleich Null! (keine tranversale Magneti- sierung)
• Funktion Puls NMR nach 90°-Puls beginnt M in der xy-Ebene zu rotieren (mit der Larmorfrequenz ω0)→ damit detektierbare, transversale Magnetisierung erzeugt! Detektion mittels Empfängerspule(n) auf der x und y-Achse → der rotierende Vektor M erzeugt dort eine sinus (cosinus) - förmige Wechselspannung mit der Frequenz ω0 nach Abschalten des Pulses (Störung der GG-Population) kehrt das System wieder ins GG (M0 in Richtung von B0) zurück (Relaxation) → der rotierende Vektor M richtet sich wieder in die z-Richtung auf - die transversale Magnetisierung zerfällt. Es resultiert in der Empfängerspule daher eine Wechselspannung mit abnehmender Amplitude, im Realfall eine Überlagerung vieler Abklingkurven - der FID (free induction decay). Umwandlung der Zeitdomäne FID (Signalamplitude als Funktion der Zeit) in die Frequenzdomäne NMR-Spektrum (Signalamplitude als Funktion der Frequenz) durch Fourier- Transformation
• chemische Verschiebung? auf 1H-Kern wirkt nicht exakt B0 , sondern bedingt durch die elektronische Abschirmung – ein etwas kleineres Feld Beff Protonen mit unterschiedlicher elektronischer Umgebung haben unterschiedliche Resonanzfrequenzen. Das 1H-NMR Spektrum einer Substanz mit unterschiedlichen Sorten von Protonen besteht daher aus so vielen Signalen, wie es verschieden Typen von Protonon im Molekül gibt. Angabe der chemischen Verschiebung nicht in Hz weil dann Aufnahmen bei verschiedenen Feldstärken nicht vergleichbar sind (ν ist von B0 abhängig – siehe Resonanzbedingung) δ-Skala: chem. Verschiebung als dimensionslose Zahl angegeben, damit unabhängig von B0 δ = (ν(Signal) − ν(TMS)) / Betriebsfrequenzoderδ (ppm) = (ν(Signal) − ν(TMS)) / MHz des Gerätes z.B. 500 MHz-Gerät, ν(Signal) = 2000 Hz → δ (ppm) = 2000/500 = 4 ppm = parts per million = 1/1 000 000 !!! (keine physikalische Einheit!)
• Wofür ist TMS gut? Es wird nicht die absolute Lage eines Resonanzsignales gemessen(z.B. 500 000 423 Hz) sondern die relative Lage zum Signal einerStandardsubstanz (Tetramethylsilan = TMS). Die Lage des Standardsignales wird definitionsgemäß 0 gesetzt.
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• Die chemische Verschiebung bei der 1H NMR Spektroskopie wird beeinflusst durch? • Induktive Substituenteneffekteelektronegative Substituenten in der Nähe des betrachteten Protons erniedrigen die Elektronendichte → Entschirmung, Tieffeldverschiebung,δ großelektropositive Substituenten erhöhen die Abschirmung →Hochfeldverschiebung, δ klein• Mesomerieffektepositive Partialladung in (relevanten) mesomeren Grenzstrukturen →Elektronenmangel, Entschirmung, δ großnegative Partialladung → hohe Elektronendichte, Abschirmung, δ klein• Anisotropieeffektedurch B0 wird ein sekundäres Magnetfeld erzeugt, welches nicht in allen Raumrichtungen gleich groß ist (anisotrop). Je nach räumlicher Lage des betreffenden Protons zu diesem Sekundärfeld kann Entschirmung oder Abschirmung erfolgen
• Eigenschaften der induktiven Substituenteneffekte? • stark nur über 1 Bindung, mit zunehmenden Abstand rasch abnehmend • Bei Mehrfachsubstitution kumulative Effekte • δ (Methin) > δ (Methylen) > δ (Methyl)
• Eigenschaften der mesomeren Effekte? Elektronen ziehende und abstoßende Effekte, sind in der O und P Stellung am größten, aufgrund der Mesomerie
• Ringstromeffekt? Der Aromat induziert sein eigenes Magnetfeld und innere Abschirmung hoch, CS gering Äußere Abschirmung gering, CS hoch Beim Benzen liegen die Kohlenstoff-Atome genau dort im Ring, wo das durch den Ringstrom verursachte Feld gleich null ist.
• magnetische Anisotropie in Cyclohexanderivaten? Hax (axial) stärker abgeschirmt als Heq (äquatorial)
• Wann sind 2 Kerne chemisch Äquivalent? chemische ÄquivalenzZwei Kerne innerhalb eines Moleküls sind chemisch äquivalent, wenn sie durch eine auf das Molekül anwendbare Symmetrieoperation ineinander übergeführt werden können, oder wenn sie durch eine schnelle (schneller als die NMR-Zeitskala), intramolekulare Bewegung im Zeitmittel identisch werden. Kerne mit identer chemischer Verschiebung nennt man isochron. Isochronie kann aufgrund chemischer Äquivalenz erfolgen oder aber auch rein zufällig bedingt sein.Befindet sich in Nachbarschaft einer CH2- (oder z.B. CMe2-) Funktion ein chirales (oder prochirales) Zentrum, sind die beiden Methylen- protonen Ha und Hb (bzw. Methylgruppen) nicht mehr chemisch äquivalent! Man bezeichnet solche Gruppen als diastereotop.
• Enantiomere Moleküle im NMR die korrespondierenden Signale optischer Antipoden sind im achiralen Milieu ident (völlig idente Spektren) erst im chiralen Milieu (chiraler Hilfsstoff, chirales LM) kann Nichtäquivalenz auftreten
• Wie kann man acide Protonen identifizieren? Man setzt D2O zu und RH wird zu RD und D2O zu HOD, der RH peak verschwindet und ein HOD peak entsteht
• Spin-Spin Kopplung? • Wenn HB einen Kern HA der Sorte ↑ ‘spürt ‘ kommt es bei (geringfügig‘) andererC-HBFrequenz zur Resonanz als wenn HA der Sorte ↓ angehört:• da beide Sorten aber statistisch gleich verteilt sind (geringe Besetzungsunterschiede hier vernachlässigbar) kommt es zu einer 1:1 Aufspaltung des Signals von HB. DerAbstand der beiden Signalkomponenten ist die Kopplungskonstante J.• J kann ein positives oder negatives Vorzeichen haben (aus dem Spektrum meist nichtdirekt ablesbar)• Kopplungen werden durch Bindungselektronen übertragen (skalare Spin-Spin Kopplung)• Kopplung erfolgt gegenseitig → analoge Situation für HA: J(B,A) = J(A,B)• die Größe von J ist unabhängig von der Stärke des äußeren Magnetfeldes B0 !!!!! Koppelt ein Proton mit n äquivalenten Nachbarprotonen, so beträgt seine Signalmultiplizität n + 1 Linien. Die relativen Signalintensitäten verhalten sich wie Binomialkoeffizienten (Pascal‘sches Dreieck).
• Quartett= Dublett eines Dublett
• Spektrenordnung Spektren 1. Ordnung: ∆ν/J > 10• Spektren höherer Ordnung: ∆ν/J < 10• mehr Linien als 1. Ordnung• δ und J können meist nicht mehr direkt abgelesen werden (Computeranalyse)• keine binomialen Intensitätsverhältnisse• oft charakteristische Dachform
• Wann sind Kerne magnetisch Äquivalent? 2 Kerne A und B sind magnetisch äquivalent, wenn siea) chemisch äquivalent sind undb) zu allen anderen möglichen Kernen, die nicht die gleiche chemische Verschiebung wie A und B aufweisen, die gleiche Kopplungskonstante besitzen. Die Kopplung zwischen magnetisch äquivalenten Kernen ist im Spektrum nicht direkt beobachtbar (aber sie existiert).
• unterschied vicinale, geminale und long-range Kopplung Geminal 2J  Vicinal 3J Longrange 4+J
• Je größer der Diederwinkel, desto... Größer die chem. Verschiebung Trans > cis
• Spin entkopplung Wird verwendet, wenn man sich nicht sicher ist, ob 2 Kerne koppeln, es wird mit der Resonanz freuquenz einer der beiden Kerne eingestraht und gescheut ob das dublett zum singulett wird.
• Eu(DPM)3? shift reagenz, mit dem man das Spektrum in eine Richtung verschieben kann, und so ev. mehr peaks sichtbar werden. paramagnetischer Komplexe
• Unterschied 1H und 13C NMR 13C: I = 1⁄2, natürliche Häufigkeit 1.1%, γ(13C) nur 1⁄4 von γ(1H) → wesentlich weniger empfindlich als 1H (PFT-Spektrometer, Spektrenakkumulation, spezielle Meßtechniken) 13C ist 'diluted spin': C—C—C—C ca. 96%, dem NMR Experiment nicht zugänglich (I = 0) diese Isotopomere werden beim 'normalen' 13C-NMR Experiment gemessen C-C-C-C Kopplungen mit Protonen sind sichtbar. Daher meist sehr viele Linien (wegen der – meist – vielen Kopplungen mit 1H). Vorteil: viel 'Nachbarschaftsinformation', Nachteil: oft unübersichtlich bis nicht mehr interpretierbar → durch verschiedene Maßnahmen (Entkopplung) Kopplungen zu 1H ganz oder teilweise eliminiert
• Ursache für die chem. Verschiebung in der 13C NMR Beff = (1 – σ) B0 (σ: Abschirmungskonstante) σ = σdia + σpara + σaniso σdia : beschreibt Abschirmung durch Elektronen mit sphärischer Symmetrie (s-Elektronen), bei 1H dominierendσpara : beschreibt Einfluss von Elektronen mit nicht-sphärischer Ladungsverteilung, negatives Vorzeichen (→ Entschirmung), dominiert bei allen Kernen außer Wasserstoff, enthält Term 1/∆E (∆E ~ mittlere Anregungsenergie), d.h. geringere Anregungsenergien führen zu stärkerer Entschirmungσaniso : beschreibt Einfluss der Anisotropie-Effekte von Nachbargruppen, weniger wichtig bei 13C als bei 1H üblicherweise gemessener Kernbereich ca. 0 – 220 ppm Referenzsubstanz: TMSδ(13C) abhängig von:1) Hybridisierungszustand des C-Atoms2) Substituenteneinflüssen 3) Elektronendichte
• Abh. Hybridisierung und CS im 13C NMR sp2: C=C~90–160ppm C=O~150–220ppm C=S ~ 180 – 240 ppm C=N ~ 110 – 160ppm > sp: C≡ C~50–110ppm C≡ N~105–120ppm > sp3: Alkane:~0–100ppm
• Substituierten Einflüsse in 13C NMR • steigende Alkylsubstitution führt zu Entschirmungδ Cquartär > δ Ctertiär > δ Csekundär > δ Cprimär > δ CH4 • elektronegative Substituenten führen zu Entschirmung CH3F 75 ppm CH3Cl 25 ppmCH3Br 10 ppm CH3I -21ppm → 'Schweratomeffekt' (Hochfeldverschiebung) Extrembeispiele: CF4 119 ppm CI4 – 292 ppm γ-Effekt: in C-Kette Abschirmung des C-Atoms in γ-Stellung zuX (X = OH, Cl, CO, ...) α-Effekte bei Dreifachbindungen stäkere Abschiermung dur alphastellung zur Dreifachbindung
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• Je geringer die Ladungsdichte im 13C NMR, desto... höher die chem. Verschiebung (ähnlich 1H NMR)
• Sind C13 Spektren integrierbar? 13C-NMR Spektren unter üblichen Aufnahmebedingungen nicht integrierbar da sehr große Unterschiede im Relaxationsverhalten der einzelnen C-Atome; quartäre C-Atome meist geringere Signalintensität.
• C13,1H Kopplung? 1J: direkte Kopplung 100 – 300 Hz, meist 120 – 200 abhängig von der Hybridisierung: sp > sp2 > sp3(Ethan: 1J = 125 Hz, Ethen : 1J = 156 Hz, Ethin: 1J = 248 Hz) elektronegative Substituenten am C-Atom vergrößern 1J 2J, 3J, 4J ..... – 10 bis 60 Hz, meist 0 – 20 Hz (Absolutbetrag) Nachteil 1H-gekoppelter Spektren: massive Signalüberlagerungen, zusätzlichVerschlechterung des Signal/Noise (S/N) durch Aufsplitten der Resonanzen in sehr viele Linien (z.B. R-CH2-CH2-CH3 → 36 Linien!⇒ Entkopplung von 1H !!
• 13C NMR Entkopplungsarten 1H-breitbandentkoppeltes13C-NMR (lauter Singuletts) off-resonance entkoppeltes13C-NMR: 2J, 3J eliminiert,1J reduziert* (SFORD) selektive Entkopplung Bei der Entkopplung erfolgt auch ein Empfindlichkeits-gewinn durch den Nuclear Overhauser Effekt (NOE)!
• APT (* SEFT = Spin Echo Fourier Transform JMODXH = J-modulated Spin-Echo) Attached Proton test Im Spektrum zeigen CH3 - und CH-Gruppen eine negative, CH2-Gruppen und quartäre C-Atome eine positive Signalintensität.
• DEPT? Distorsionless Enhancement by Polarisation Transfer In der 13C-NMR-Spektroskopie können mit Hilfe des DEPT-Verfahrens die Signale von C-Atomen mit 0,1,2 oder 3 direkt gebundenen Protonen ohne Signalaufspaltung voneinander unterschieden werden. n der Praxis hat sich die Aufnahme von DEPT 90 (θ=90°) - Spektren (nur CH-Gruppen sichtbar) und DEPT 135 (θ=135°) - Spektren ( CH3- und CH-Gruppen zeigen ein positives, CH2-Gruppen ein negatives, quartäre C-Atome geben kein Signal) durchgesetzt.
• Inkrement Berechnung In einigen Fällen kann die chemische Verschiebung mit Hilfe von Inkrementen berechnet werden. Inkremente sind additive Beiträge, die den Einfluss von Nachbaratomen auf den betrachteten Kern und somit seine chemische Umgebung widerspiegeln. Sie setzen sich aus elektronischen und sterischen Beiträgen zusammen und wurden durch die Auswertung einer Vielzahl von Messdaten bestimmt. Somit sind die mittels Inkrementen erhaltenen chemischen Verschiebungen eher Abschätzungen als exakte Berechnungen. Mit Ausnahme von Verbindungen mit besonderen sterischen und elektronischen Wechselwirkungen erhält man allerdings eine recht gute Übereinstimmung zwischen berechneten und gemessenen Verschiebungen.
• 2D-NMR • Evolutionsphase t1 wird systematisch variiertEvolution mix• FID damit von 2 Zeitvariablen abhängig (t1,t2)• 2 × Fourier-Trasformation (nach t1 und t2)• Signal durch 2 Frequenzen charakterisiert Präparation -> Evolution/ Mixing -> Detektion -> FID δ,δ-Spektren: auf beiden Achsen chemische Verschiebungen δ,J-Spektren: auf einer Achse chem. Verschiebung, auf der anderen Kopplung
• COSY (Correlated Spectroscopy) Information über das Kopplungsnetzwerk (welches H koppelt mit welchem H?) Diagonalsignale: 'normales' Spektrum Kreuzsignale: zeigen Korrelationen an
• HETCOR (idente Information: HMQC, HSQC)*? → Welches H hängt an welchem C Mischung 13C und 1H Spektroskopie in 2D
• HMBC? C,H-Korrelation über mehrere BindungenKorrelation über eine Bindung (1J) wird unterdrückt Chinin – HMBC, Aromatenbereich HeteronuclearMultipleBondCorrelation
• NOESY? Räumlich benachbarte Kerne (d < ~ 3.5 - 4Å) geben Kreuzpeaks(off-diagonal)→ Distanzinformation! NOEs bei der Strukturbestimmung von Proteinen
• Durchführung einer NMR-Messung Probe wird in deuteriertem Lösungsmittel gelöst; häufig verwendet: CDCl3, d6-DMSO, d6-Aceton, d6-Benzol, D2O• Lösung wird in zylindrisches Röhrchen (NMR-tube, Durchmesser meist 5 mm) gefüllt und dieses mit Teflonkappe verschlossen• Röhrchen wird mit Spinnerturbine versehen (richtige Position wird mit Schublehre eingestellt – siehe Bild)• Röhrchen wird in der Bohrung des Magneten (oder im Autosampler) platziert und mittels Pressluftstrom in den Probenkopf befördert‚Lock‘ (Konstanthalten des Feld/Frequenz-Verhältnisses via Deuterium-Signal)‚Shim‘ (Feinhomogenisierung des Magnetfeldes via Shimspulen)Abstimmung der Receiver-EmpfindlichkeitMessung durch Acquisition und Addition mehrerer Pulse (scans)→ FID• Prozessieren (FT, Phasenkorrektur) meist dezentral
• Anwendungen der NMR in der pharm. Analytik? • Analytik in der Synthese: Kontrolle präparativen Arbeitens (Konstitution, Einheitlichkeit, Verunreinigungen)• Strukturbestimmung in Lösung: Konstitution und Stereochemie, von Syntheseprodukten, Naturstoffen, Biomolekülen; auch für größere Moleküle (z.B. Proteine zur Zeit bis ca. 30 kD ~ 250 Aminosäuren, allerdings erst nach Isotopenanreicherung)• Untersuchung intermolekularer Wechselwirkungen(Enzym-Inhibitor, DNA-Interkalator oder Repressor, Rezeptor- Substrat, Rezeptor-Arzneistoff, Antikörper-Antigen usw.)• Untersuchung der molekularen Dynamik(via Relaxationsparameter), z.B. Proteinfaltung, Proteinfunktion• Bestimmung von Diffusionsparametern
• Karplus-Kurve Abh. der Kopplungskonstante 3J von dem Diederwinkel Φ
• ortho meta para Kopplungskonstanten? 3J: 7-9 Hz Ortho 3J: 1-3 Hz Meta 3J: <1 Hz Para

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