Definition Pränataldiagnostik
im weiteren Sinne: Jede vorgeburtliche Diagnostik mit dem Ziel der abschätzung der Prognose oder vorgeburtlichen Therapiemöglichkeiten im engeren Sinne: Diagnostik, die den Ausschlus bzw die Feststellung schwerer angeborener Erkrankungen oder Fehlbildungen zum Ziel hat.
Identikationen für Pränataldiagnostik (4)
Erhötes Alter der Mutter Vorangegangenes Kind mit einer genetischen Erkrankung Balancierte Translokation bei einem Elternteil Risiko eines Neuralrohrdefekts
Nicht invasive Untersuchungen
Ultraschalluntersuchung: Kontrolle von Wachstum des Feten, Lage der Plazenta, Fruchtwassermenge, Nackentransparenz, Softmarker (echogener Darm, Plexus choroideus-Zyste, fehlendes Nasenbein u.a)
Methoden der pränatalen Diagnotik:
1. nicht invasiv (3)
2. invasiv (4)
nicht invasiv: Ultraschall, mütterliche Blutentnahme, CTG Invasiv: Amniozentese, Chorionzottenbiopsie, Plazentozentese, Nabeschnurpunktion ( Fetoskopie)
Zeitpunkt des 1. Screening und Untersuchungen?
Sonographische und biochemische Marker?
9.-12. SSW Vitalität? Mehrlinge? zeitgerechte Entwikclung? Ausschlus grober Auffälligkeiten? Sonographische und biochemische Marker: NT- Messung (fetale Nachentransparenz. normal: 1,3-2,3 mm). subkutane Flüssigkeitsansammlung im Bereich des fetalen Nackens nachweisbar in 11.-14. SSW PAPP-A (Pregnancy-associated plasma protein A) und freies ß- HCG in mütterlichem Blut. it zunehmendem Schwangerschaftsalter: PAPP-A↑, β-HCG↓ bei Trisomie 21: höhere ß-HCG Werte, niedrigere PAPP-A Werte. ! unter Berücksichtigung des mütterlichen Alters werden ca. 90% der Feten mit Down-Syndrom erkannt.
Invasive Diagnostik 1:Choionzottenbiopsie (CVS)
Zeitraum?
Chorionzotten?
Dauer bis zum Befund?
Risiko einer Fehlgeburt?
ab 11. SSW bis 12. SSW Chorion = Zellschicht an der Außenseite der Fruchtblase. Zu Beginn der Schwangerschaft dich it Zotten (fingerförmige Ausstülpungen) besetzt, von denen bei der CVS eine Probe entnommen wird. Transzervikal oder transabdominal Dauer bis zum Befund: Dirketpräperation: 1- 2 Tage Langzeitkultur: 8-10 Tage Risiko einer Fehlgeburt: ca. 2%
Invasive Diagnostik: Amniozentese
Zeitraum?
Untersuchung?
Fehlgeburtenrate?
Zwischen 15. und 17. SSW transabdominale Entnhame von 10-20ml Fruchtwasser (enthält kidnliche Zellen von Haut, Urogenitaltrakt oder Amnionhülle) Zellkultur -> Chromosmenanalyse unkultivierte Zellen -> Interphase FISH -> Aneuploidien biochemische Untersuchungen -> Hinweis auf Neuralrohrdefekte, Sauerstoffversorgung des Fötus und Gehirnbildungen Fehlgeburtenrate: 05, - 1 %
Amniozentese: Schnelltest und Zellkultur basierter Prozess
10-20 ml Fruchtwasser. 1. Zellkultur -> Überstand: Bestimmung von AFP (Alpha fetoprotein) und oder Acetylcolinesterase (AChE) -> Sediment: Anlegen von zwei parallelen Zellkulturen Wachstum und Teilung der Zellen in den Kulturen: 37,5°C und 5% CO2 (Medienwechsel und Begutachtung) Kulturabbruch nach 10-14 Tagen, Chromosomen-Präparation, Bänderung -> Mikroskopische Analyse und Karyogrammerstellung 2. Schnelltest -> FISH mit spezifischen Proben für die Chromosomen 13,18,21, X, und Y -> Molekulargenetischer Schnelltest durch PCR ( 13,18,21,X,Y) Ergebnis nach 1-2 Tagen
Vor und Nachteile der pränatalen Interphase-FISH technik (= Fischschnelltest)
Vorteile: Zeitgewinn: Ergbenis innerhalb von 24h Nachteile: nur Nachweis von numerischen Aberrationen kein Ersatz für Chromosmenanalyse leicht erhöhtes Abortsrisiko (10ml mehr Fruchtwasser benötigt)
Molekularer Schnelltest
Bestimme Gene auf welchen ein nur geringer Selektionsdruck liegt, haben häufig eine unterschiedliche Anzahl von repeats. -> Fluoreszenz-markierte Primer führen zu fluoreszierenden PCR-Produkten. Homozygot: beide Allele gleich lang Heterozygot: unterschiedliche Größe der Allele; können so voneinander getrennt werden Multiplex PCR -> mehr als 10 Amplikons per Ansatz (verschiedene Marker) Primer mit unterschiedlichen Fluoreszenzen markiert Auswertung: Verhältnis der Peaks zwischen 0,8 und 1,4 → normalVerhältnis der Peaks größer als 1,8 bzw. kleiner als 0,65 → TrisomieVerhältnis der Peaks im Grenzbereich → inconclusive Bei Homozygoten Allelen -> keine Aussage möglich (wenn nur ein peak vorhanden) 2 gleich hohe peaks -> normal heterozygot 1 hoher peak ein niedriger -> Hinweis auf Trisomie (2x homozygot + weiteres Allel) 3 gleich hohe peaks -> trisomie , selbes allel Mindestens zwei informative Marker pro Chromosom sind nötig, um eine Aussage treffen zu können!
Probleme molekularere Schnelltests
- zu wenig Material - nicht informative Markerkonstellation - kene Einzelzellanalyse (Moksaik)
Mögliche Erklärungen für Mosaike im Chromosomenbefund bei CVS- Ergebnissen
- mütterliche Kontamination - Kulturartefakt (Überprüfung anhand des 2. Kulturansatzes) - Plazentamosaik - Mosaik beim Feten Ggf. Amniocentese zur Überprüfung weiterer Untersuchungen postnatal
Beurteilung Mosaikstatus
1 Zelle in 1 Kultur abnormal: Pseudomosaik Level 1 MosaikMosaik mit >_2 Zellen in >_2 Kulturansätzen Level 3 MosaikMosaik mit >_2 Zellen in 1 Kulturansatz Level 2 MosaikV.a. Kulturartefakt, 20% Risiko für Mosaik beim Feten
Nabelschnurpunktion (Chordozentese)
ab?
diagnostische Gründe?
therapeutische Gründe?
ab 18 SSW diagnostische Gründe: nur bei speziellen Fragestellungen wie: -Verdacht auch kindliche Anämie - kindl. Infektionen -Blutgruppenunverträglichkeit -Auffälligkeiten im Ultraschall -Kontrolle beo schwer interpretierbaren Ergbnissen der Amniozentese therapeutische Gründe: -Bluttransfusion - Medikamentengabe Fehlgeburtenrisiko: 2-4
Präimplantationsdiagnostik
def.
ablauf
Molekulargenetisches Diagnoseverfahren zur Untersuchung von Embryos vor Implatation -> nur bei in-vitro-Fertilisation/ ICSI (Intracytoplasmatische spermien injektion) Blastocystenstadium: 4 Tage nach der Befruchtung -> Entnahme von 1-2 Zellen zur Untersuchung -> PCR-basiert -> FISH-basiert -> Selektion der Embryonen -> Transfer der Embryonen nach Ausschluss der Erkrankung
Embryonen Schutzgesetz
- Totipotente Zellen beim Säuer vis zum Achtzeller (72h) - Eine totipotente Zelle ist ein Zwilling - Verbot der Embryonen-verbrauchenden Diagnostik Bei Vorliegen der Vorraussetzungen sich zu teilen und zu einem Individuum zu entwickeln
Polkörperdiagnostik (PKD)
- erlaubt indirekte Aussage über genetische Konstitution der Eizelle - im Rahmen der IVF/ICSI - Nachteil: nur Mütterliches Erbgut beurteilbar, paternale genetisch Faktoren sind nicht, monogene Erkrankungen nur eingeschränkt diagnostizierbar - v.a Nachweis von Chromosmenfehlverteilungen (Aneuploidien) -> FISH-Analyse der Chromosomen 13,16,18,21,22 Ziel : Vermeidung der Übertragun aneuploider Embryonen -> verbesserte Behandlungserfolge bei assistierter Reproduktion
ccff-DNA: Circulating cell-free fetal DNA
ccff DNA istnach dder 4.SSW nachweisbar und verschwindet wenige Tage nach der Geburt. Anteil fetaler DNA an der gesamten Zell freien DNA variert zwischen 2% und 40% mit einem Mittelwert von 10%. (10. SSW)
Chromosomenanalyse an ccff DNA
Bei einem euploiden Genom stammen etwa 8.5% der Fragmente von Chromosom 1, 1.35% von Chromosom 21 und 1.2% von Chromosom 22. -> Bei einer Schwangerschaft mit Trisomie 21 steuert der Fet mehr Fragmente von Chromosom 21 zu allen Fragmenten bei als bei einer euploiden Schwangerschaft. Vorsicht: Nur etwa 10% der sequenzierten Fragmente repräsentieren den Feten und ca. 90% die Mutter, d.h. man arbeitet auf einem Hintergrund mütterlicher DNA. Die Auswertung (Diagnose) erfolgt mit einem Algorithmus (z score), der anhand der Ergebnisse bei einer grossen Zahl von euploiden und Trisomie 21- Schwangerschaften „trainiert“ wurde.
Probleme der NGS-Diagnostik: Blut
(next generation sequencing)
- etwas 5-10% der mütterlichen Plasma probe erfüllen nicht die Qualitätstandarts für NGS -Bei Hämolyse erhöht sich der Anteil mütterlicher DNA,d.h. es ist kein langer Versandweg möglich) -Bei <8% ccff DNA im mütterlichen Serum nimmt die Anzahl nicht auswertbarer Test zu. - Mit zunehmenden Körpergewicht der Schwangeren steigt der Anteil nicht auswertbarer Fälle mit <4% ccff DNA. Bei Schwangeren >140 kg sind 30% der Test nicht auswertbar oder falsch-negativ.
NIPT (Non invasiv pränataltest):
Indikationsstellung durch den Arzt
- Bisher wird der Test ganz überwiegend Frauen mit einem hohen Risiko für Chromosomenstörungen beim Kind und mit erfolgtem Ersttrimesterscreening angeboten. Vor dem Test muß eine Genetische Beratung, die den Anforderungen des GenDG genügt, angeboten werden. Die Mitteilung des Befundes, insbesondere bei Auffälligkeiten erfolgt ebenfalls in einer Beratung.Diese Beratungen sind oft komplex und zeitaufwendig,sind aber nur schlecht abrechenbar. Die Haftung liegt beim Arzt, der das Blut abnimmt und verschickt, der finanzielle „Gewinn“ bei dem durchführenden Labor. Auffällige Befunde müssen i.d.R. durch eine invasive Pränataldiagnostik bestätigt werden.
