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Instrumentelle Analytik (Subject) / Biokritsllographie Seite 1 (Lesson)

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• Was ist typisch, was zwingend für einen Kristall? typisch: Glatte Flächen, Glanz, Lichtreflektion, Härte zwingend: wiederholende Einheiten
• Kristallisationsmethoden im Überblick The Classic: Hang-drop vapor diffusion The Variant: sitting-drop vaper diffusion Microbatch under oil Microdialysis Free-interface diffusion
• Beschreibung der Dampfdiffusion Dampfdiffusion mit hängendem Tropfen Die Vertiefung (well) wird mit ca. 0,5 ml Reservoirlösung gefüllt.Auf einem Deckgläschen (cover slide) werden ca. 2 ml Proteinlösung mit 2 ml Reservoir gemischt.Die Vertiefung wird mit Silikonfett abgedichtet und mit dem Deckgläschen verschlossen.Die Tropfen (drops) werden im Tages- bis Wochenabstand unter dem Mikroskop betrachtet.Erfolgreiche Kristallisationen erfolgen meist innerhalb von 4 Wochen, in seltenen Fällen bis zu Jahren.
• Prinzipelle Anteile eines Kristallisationsansatzes Proteinkonzentration: typisch 3-30 mg/mlPuffer, typisch 100 mM, pH 5-9Präzipitant: Salze und (Poly-)alkoholeAdditive: mehrwertige Ionen, Aminosäuren, Liganden, etc.
• Phasendiagramm und Verlauf der Kristallisation unten links: stabile Lösung (Proteih fällt zu schnell aus (Phasenseparation)) oben rechts: instabile Keimbildung (Protein fällt nicht aus) dazwischen: metastabil Kristallwachstum x-Achse: Präzipitantkonzentration y-Achse: Proteinkonzentration
• Was sind Kristallisationsscreens und wie stellt man sie zusammen? Aus den am häufigsten erfolgreichen Bedingungen wurden (kommerzielle) Screens erstellt.Ein Screen enthält z.B. 96 oder 240 verschiedene Bedingungen.
• Was passiert beim Seeden? Da der geschwindigleitsbestimmende Schritt bei der Kristallisation die Keimbildung ist, kannman durch Zugabe von kleinen Kristallen brauchbare Kristalle bekommen.Dazu muss man bereits Kristalle haben. Diese müssen allerdings weder groß noch gut sein.Manchmal funktioniert auch Seeding mit Apoproteinkristallen oder gar Kristallen anderer(verwandter) Proteine. Auch Staub kann als (unfreiwilliger) Keim fungieren.
• Was macht ein Kristallisationsroboter? Aus einer Vorratsplatte (stock) werden die 96er oder 356er Platten befüllt und mit Proteinlösung gemischt. Die fertig pipettierte Platte wird folien-versiegelt und gelagert (z.B. In einem Plattenhotel).
• Manipulation und Lagerung von Proteinkristallen Proteinkristalle sind weich, zerbrechlich und dürfen nicht austrocknen.Sie müssen daher ständig von Flüssigkeit (zB. Mutterlauge) umgeben sein und dürfen keinem mechanischen Stress ausgesetzt werden. Geeignet sind Schlaufen (Loops) aus Mylarfolie (PET) oder Nylonfaser
• Unterschied Kokristallisation und Soaken Soaken: Der Kristall wird in eine neue Lösung mit Ligand überführt. Es kann auch dieLigandlösung zum Tropfen pipettiert werden. Die Soakingzeiten liegen meist im Minutenbereich Vorteil: mit einer Standardbedingung können viele Kristalle vorbereitet werden.Nachteil: Wechsel des Lösung nötig Kokristallisation: Der Ligand wird bereits zum Kristallisationsansatz zugefügt. Bei schwacher und labiler Bindung muss ein Überschuss zugegeben werden. Bei fester oder kovalenter Bindung kann überschüssiger Ligand durch Dialyse oder Gelfiltration abgetrennt werden. Vorteil: kein Manipulieren des Kristalls erforderlich.Nachteil: der Ligandzusatz erfordert u.U. neue Kristallisationsbedingungen.
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• Woher stammen die Proteine für die Kristallisation? Ort in der Zelle: normalerweise cytoplasmatische Proteine werden extrahiert und aufgereinigt
• Warum sollte man ein Alignment seiner Proteinsequenz machen? Aus einem breit angelegten Alignment lassen sich Vorgänger erschließen, die oftthermophil sind, wenn sie weit genug zurückreichen.
• Was kann man beim Designen rekombinanter Proteine berücksichtigen? Vorteil: Sequenzen und Konstrukte sind anpassbar, Produktion ist im LaborreproduzierbarNachteil: Klonierung erforderlich, heterologe Expression führt u.U. zu nichtgefaltetem oder nicht modifiziertem Protein
• Tags und Fusionsproteine, Typen und Zweck Affinity TagsBei rekombinanter Expression wird die Sequenz oft so modifiziert, dass die Reingungerleichtert wird. His-Tag / Strep-Tag: Binden spezifisch an Säule Poly-Arg, Poly-Glu: Verschiebung des pI Wertes, um eine leichtere Reinigung mit Kationen- oder Anionenaustauscher zu ermöglichen Fusionsprotein entsteht durch die gemeinsame Expression zweier Gene oder Genteile, die hintereinander im Genom liegen. BCR-ABL-Genprodukt
• Einbau und Verwendung(szweck) von Selenomethionin Die nichtnatürliche AS Selenomethionin wird von der Aminoacyl tRNA Synthetase für Methionin fälschlicherweise eingebaut. Das ermöglicht den Einbau in Proteine, wenn kein Methionin zur Verfügung steht.Entweder wird ein Met auxotropher Stamm verwendet oder die Met-Synthese wirdmetabolisch unterdrückt.
• Reinigungsmöglichkeiten (Inclusion bodies) Affinitätschromatographie Gelfiltration Ionenaustauscher Hydrophobe Interaktionschromatographie HIC
• Welche Eigenschaft charakterisiert man mit Gelfiltration, Thermoflour, DLS, SAXS, CD Gelfiltration kann zur Reinigung, zur Reinheitsprüfung und zur Bestimmung desOligomerisierungsgrades genutzt werden. Thermofluor: Methode zur Bestimmung stabilisierender (Puffer-)Bedingungen. Dynamische Lichtstreuung (DLS): DLS misst die Fluktuation des Streulichts einer Proteinlösung. Daraus wird der Diffusionskoeffizient berechnet, der in eine Teilchengröße und das Molekulargewicht (für globuläre Proteine) umgerechnet werden kann. Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS):Auch Röntgenstrahlung wird an Partikeln in Lösung gestreut. Die Streukurve ist formund noch stärker größenabhängig. Circulardichroismus (CD) Circular polarisiertes Licht: Optisch aktive Substanzen absorbieren rechts und links circular polarisiertes Licht unterschiedlich stark. Aus der Absorptionsdifferenz wird die Elliptizität als Maß für die CD berechnet
• Einheitszelle: Translationssymmetrie, Zellparameter, Zentrierung Translationssymmetrie: Im mehrdimensionalen Raum müssen die Translationsvektoren linear unabhängig sein, aber nicht unbedingt senkrecht aufeinander stehen. Im n-dimensionalen Raum reichen n Vektoren, um die Zelle zu beschreiben. Für die 3-dimensionale Einheitszelle heißen sie a, b und c. Zellparameter: Bei den Zellparametern wird 90°, 90°,γ                90°, 90°, γ* = 180° - γ.Andere Zellparameterbeziehungen sind komplexer. Zentrierung Verwendung einer Zentrierung vereinfacht aber die Beschreibung, wenn weitere Symmetrieelemente dabei sind. ist der Vektor  c
• Was ist die asymmetrische Einheit Punktsymmetrie (Inversion, i) (Geraden)Spiegelung (Mirror, m) Mit dem zweiten Symmetrieelement (das erste ist die Identität) gibt es jetzt zwei symmetrisch identische Moleküle oder Einheiten in der Einheitszelle. Man braucht also nur die Hälfte zu beschreiben, den Rest erledigt die Spiegelung. Die zu beschreibende Hälfte ist die asymmetrische Einheit.
• Symmetrieelemente für Biomoleküle Achsen:Mit TranslaIonssymmetrie lassen sich nur2, 3, 4 und 6-zählige Achsen verknüpfen (sonst auch unendlich).Drehachsen: 2, 3, 4 und 6Schraubenachsen: 21, 31, 32, 41, 42, 43 und 61, 62, 63, 64, 65
• Molekülsymmetrie und Punktgruppen ohne deren Namen PunktgruppenDa es jede ganzzahlige Drehachse n gibt, gibt es unendlich viele Punktgruppen.Mit 2, 3, 4 und 6 zähligen Achsen gibt es jedoch nur 11 chirale Punktgruppen.Symbole nach Hermann-4auguin (Schoenflies):zb :1 (E), 2 (C2), 222 (D2) Beispiel der Punktgruppe 222: Elemente: Identität und 3  2-zählige DrehachsenVerknüpfungen: Die Drehungen 2y und 2x hintereinanderausgeführt ergeben dasselbe wie die Drehung 2z.
• Lokale und globale Symmetrie Nichtkristallographische Symmetrie (NCS) funktioniert lokal, aber nicht global. Lokale Symmetrien: innerhalb der Einheitszelle Globale Symmetrien: Über Einheitszellen hinweg
• Kristallsysteme Nach der Symmetrie der Gitterpunkte erhält man 6 Kristallsysteme (oder 7, wenn mantrigonal und hexagonal trennt): triklinic:                                   a ≠ b ≠ c   ||   α ≠ β ≠ γ ≠ 90° monoclinic:                             a ≠ b ≠ c   ||   α = γ = 90°          || β ≠ 90° orthorhombic:                         a ≠ b ≠ c   ||   α = β = γ = 90° trigonal, hexagonal:                a = b        ||   α = β = 90°          || γ = 120° tetragonal:                              a = b         ||   α = β = γ = 90° cubic:                                      a = b = c   ||   α = β = γ = 90°
• Was steht prinzipiell in den International Tables? Hermann-4auguin Symbol Punktgruppe Kristallsystem Symmetrieelemente Generelle Positionen
• Was sind kartesische und fraktionelle Koordinaten kartesische Koordinaten x, y, z fraktionelle Koordinaten in Bruchteilen der Basisvektoren a, b, und c der Einheitszelle.
• Grundkonzept des reziproken Raums Der reziproke Raum ist eine mathematische Konstruktion, die zur Beschreibung der Beugungsdaten „erfunden“ wurde. Die gemessenen Daten (Reflexe) sind Gitterpunkte im reziproken Raum. Das reziproke Gitter lässt sich aus Gitterebenen im realen Raum konstruieren: Durch 2 Gitterpunkte auf der a und b Achse (im 2D Raum) legt man eine Gerade.Parallel dazu gibt es weitere Geraden, eine Geradeschar (im 3D eine Ebenenschar).Senkrecht zu dieser Schar und mit der Länge 1/d zeichnet man die Vektoren des reziproken Raums. Ist die reale Zelle groß, ist die reziproke Zelle klein, z.B. V* = 1/V.

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