sekundäre inhaltsstoffe (Subject) / 9. Analytik sekundärer Inhaltsstoffe (Ascorbinsäure, Vit. E-Tocopherol) (Lesson)

Uni Bonn WS'17/'18

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• Vitamin C: Vorkommen, Dosierung (Mangel, Überdosierung), Chemische Struktur Vitamin C (Ascorbinsäure): umfasst Stoffe, die im Körper zu L-(+)-Ascorbinsäure umgesetzt werden können.z. B die Dehydroascorbinsäure (DHA). Vorkommen: a) Obst: Johannisberren, Kiwis, Zitrusfrüchte (Orangen, Zitronen, Grapefruits), b) Gemüse: Paprikafrucht, Petersilie, Grünkohl 4 vers. stereoisomeren Formen→ nur L-(+)-Ascorbinsäure weist jedoch biologische Aktivität auf. Menschen können Ascorbinsäure NICHT selber synthetisieren.→ Tagesbedarf ca. 50-100 mg durch Verzehr von pflanzlichen LM. a) Hypervitaminose: Selten, da wasserlöslich wird Überschuss leicht über Nieren ausgeschieden.b) Hypovitaminose: langfristig zu(m/r) Skorbut & Schwächung des Bindegewebes Chemische Struktur:https://www.lernhelfer.de/sites/default/files/lexicon/image/BWS-CHE-0556-05.gif
• Biologische Funktion Vit. C Biologische Funktion Vit. C (Ascorbinsäure): 1. Enzymatischer Cofaktor:  Cofaktoren: Ascorbinsäure & dessen oxidierte Form (DHA) für viele biochemische Reaktionen. 2. Radikalfänger (Scavengers) in Pflanzen & Tieren:– wirkt enzymatisch & nicht-enzymatisch auf Sauerstoffradikale & reaktive Sauerstoffspezies (ROS):       AscH2 + H+ + O2• – —→ H2O2 + Asch• O2• – : Superoxid-Ion: stammt aus molekularem Sauerstoff, der bei der Endreaktion der Atmungskette statt vier nur ein Elektron erhalten hat.  H2O2: Wasserstoffperoxid wird durch das Enzym Katalase abgebaut.Asch• : Ascorbyl-radikalen: Sie reagieren miteinander zu Ascorbinsäure & Dehydroascorbinsäure.             2 AscH• ———> AscH2 + Ascox– Beteiligung an der Regeneration des lipophilen membran-assozierten α-Tocopherols   → Tätigkeit auch in lipophilem Gewebe weil der Radikalmechanismus am besten in unpolarem Milieu abläuft.
• Radikale der Ascorbinsäure Radikale der Ascorbinsäure: Abgabe 1 e–: Ascorbyl-Radikal (AscH•)                           Abgabe 2 e–: Dehydroascorbinsäure (DHA)                      → Sehr Stabil & UNreaktiv                       → können aber wieder mit AscH• enzymatisch in Ascorbinsäure reduziert werden.
• Vitamin C als Antioxidans: Vit. C reduziert...: Verbindungen mit ungepaarten Elektronen (Radikalen) Verbindungen, die reaktiv aber keine Radikale sind: z. B. Nitrosamine Verbindungen, die durch Reaktionen mit Radikal enstanden sind & dann mit Vit. C reagieren: z. B. Reduktion Tocopheroxyl Radikal            FS-Peroxyradikal –→ FS-Hydroperoxidα-Tocopherol ←–————————–→ α-Tocopherol-Radikal             Ascorbyl-Radikal ←– Ascorbinsäure  Übergangsvermittelte Reaktionen mit Eisen & Kupfer
• Ascorbinsäure: Antioxidans oder Co-Antioxidans Ascorbinsäure - haben eig. gar kein antioxidative Wirkung alleine!
• Analytische Methode, die Ascorbinsäure identifizieren, quantifizieren usw. können; Vor- & Nachteile der Methode Analytische Methoden: Ascorbinsäure  Spektro-photometrische Methoden:(–): Mangel an Sensitivität & Spezifität HPLC-UV i) L-Ascorbinsäure wird durch Meta-phosphor-säure aus der Probe extrahiertii) L-Dehydroacorbinsäure wird erst zu L-Ascorbinsäure reduziert → Gesamtgehalt wird bei 285 nm gemessen(+): Keine unspezifischen Interferenzen,        Hohe Sensitivität & Spezifität(–): Lange Analysezeiten HPCE (High-Performance Capillary Electrophoresis):(+): Schnellere Analyse        Geringere Probemengen(–): Konzentrationsnachweisgrenze höher als bei HPLC
• Beispiele für chromatographische Methoden Chromatographische Methoden: Dünnschichtchromatographie  (TLC) Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) Gaschromatographie (GC) ⇒ Gekoppelt mit Massenspektrometrie 
• Wann HPLC & Wann GC? 1. HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, High Performance Liquid Chromatography) Relativ große Moleküle, Löslich in Wasser od. Lösungsmittel, Dürfen hitzelabil sein  2. GC (Gaschromatographie Gas chromatograph):  Leicht flüchtige Verbindungen Dürfen unlöslich in Lösungsmitteln sein  Hitzeresistent
• Prinzip von HPLC HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, High Performance Liquid Chromatographie) = eine schnelle Trenntechnik Das zu trennende Gemisch mit Hilfe eine Lösungsmittels/Lösungsmittelgemisch zur Säule gebracht.– Säule = Rohr aus rostfreiem Stahl, das mit stationärer Phase gefüllt ist. An der stationären-Phase werden die zu trennenden Komponenten je nach Stärke der Wechselwirkungen:– unterschiedlich lang aufgehalten (Retentionszeiten) &– verlassen nach unterschiedlichen Zeiten die Säule   wo sie dann mit einem geeigneten Detektor nachgewiesen werden können. Damit werden die Substanzen getrennt, können auch über Standards identifiziert & quantifiziert.  Aufbau: http://www.laboratory-journal.com/sites/git-labor.de/files/images/special/53056402__original.jpg
• Bei HPLC werden ver. Arten von Wechselwirkungen genutzt...: In HPLC werden ver. Arbeitweisen unterschieden...: 2 Arten von Wechselwirkungen werden bei der HPLC genutzt: Adsoprtionschromatographie:– Substanzen werden durch unterschiedlich starke Dipol-Dipol Wechselwirkung mit der stationären Phase getrennt   ⇒ ist die Verweildauer unterschiedlich lang Verteilungschromatographie:–  durch unterschiedliche Löslichkeit getrennt 2 Arbeitweisen werden in der HPLC unterschieden: Isokratisch: – Zusammensetzung der mobilen Phase bleibt konstant & damit auch die Fließstärke. Gradienten-elution: – Mobile Phase wird während des Vorgangs verschieden zusammengesetzt  & die Fließmittelstärke erhöht.                    
• Wir wird die HPLC-Apparatur aufgebaut? (Allg. Durchführung) HPLC-Apparatur: http://www.laboratory-journal.com/sites/git-labor.de/files/images/special/53056402__original.jpg Eluentenreservoir: (Eluent - mobile Phase)– Flüssigkeit, in der die Probe gelöst wird Pumpe:– Pumpt die mobile Phase durch die Säule & baut den hohen Druck auf Mischventil:– vermischt die ver. mobilen Phasen Probenventil – Probe wird in den oberen Kanal eingespritzt & nach unten gedrückt– Probeninjektion erfolgt durch einen Autosampler od. durch Handinjektion– Injektionsvolumen wird durch auswechselbare Probenschleife bestimmt Trennsäule:– Elemente sind wegen der Wechselwirkungen mit stationären Phase ungleich schnell & werden unterschiedlich stark aufgehalten. Lichtquelle Detektor: – Beobachtet die mobile Phase, in der die Stoffe einer nach dem anderen herauskommen
• Was versteht man unter Normalphase/Umkehrphase bei der HPLC? Stationäre Phase: hat die Form einer gepackten Säule. Das Füllmaterial ist für die Art & Stärke der Wechselwirkung verantwortlich. 1. Normalphasen: Kieselgele od. Aluminiumoxide→ an denen reine Adsorptionsvorgänge an den polaren OH-Gruppen zur Trennung ausgenutzt werden. 2. Umkehrphasen: Die Polaritätsverhältnisse sind "umgekehrt" im Vergleich zu den Normalphasen. Unpolare Seitenketten sind an ein Kieselgelgerüst od an ein Polymer gebunden. → Dadurch verhalten sie sich hydrophob.→ Phase wird unpolarer mit zunehmender Kettenlänge Der Trennprinzip basiert auf Van-der-Waals-Kräften.
• Beispiele von nicht spektroskopische HPLC-Detektoren Nicht spektroskopische HPLC-Detektoren: UV/VIS-Detektor Fluoreszenzdetektor Refraktometrischer Detektor (RI) Elektroanalytischer Detektor Leitfähigkeitsdetektor
• Erklären Sie die Kennzahlen eines Chromatogramms 1. Brutto-Retentionszeit tR: ist die Zeit, die von der Probenaufgabe bis zum Erreichen des Peakmaximums einer Komponente vergeht. liefern eine qualitative Aussage über die enthaltenen Komponenten. ist charakteristisch je nach Verbindung, wenn die chromatographischen Bedingungen streng konstant gehalten werden.→ dazu wird die vermutete Substanz als Standard injiziert & die Retentionszeiten verglichen. 2. Totzeit t0: umfasst die Zeitdauer, die eine Substanz  mindestens in einer chromatographischen Anlage verweilt, auch ohne Wechselwirkungen mit der stationären Phase. 3. Netto-Retentionszeit tR': = Bruttoretentionszeit – Totzeit gibt die Aufenthalts-zeit der Komponenten innerhalb der stationären Phase an. 4. Peakbreiten (Peak-Halbwerts-breite w½, Basispeak-breite w) dienen zur Auflösung- & Boden-zahl-berechnung 5. Höhe, h & Fläche A: werden zum Quantifizieren der Komponenten benötigt.
• Hauptformen des Vitamin E 4 Hauptformen des Vitamin E: Tocoherol = α-Tocopherol kommt am häufigsten vor, mit einer gesättigten Seitenkette Tocotrienol =  weißt jedoch einen dreifach (T3) ungesättigten Rest auf.  Tocomonoenol  MDT (Marine derived tocopherols)
• Vorkommen des Vitamins E Vorkommen des Vitamins E: Nur von photosynthetisch  aktiven  Organismen (Pflanzen; Cyanobakterien) gebildet. Essentiell - muss mit Nahrung aufgenommen werden. Pflanzliche Produkte: v. a. in pflanzlichen Ölen: (0,04-3 g/kg)– Sonnenblumenöl– Weizenkeimöl– Rotes Palmöl Obst & Gemüse: (zw. 0,3-1 mg/100g):– schwarze Johannisbeeren– Pflaumen Bestandteil  aller Membranen tierischer Zellen im Menschen: höchster Anteil im Fettgewebe
• Eigenschaften & Funktion des Vit. E Eigenschaften Vit. E: Fettlöslich Nicht sehr hitzebständig Funktion des Vit. E Radikalfänger:– schützen  mehrfach ungesättigte Fettsäuren in Membranlipiden, Lipoproteinen & Depotfett vor Lipidperoxidation Hemmt entzündliche Prozesse Dient der Zellerneuerung & -differenzierung Stärkt das Immunsystem Vitamin E als Signaler
• Absorption, Transport, Metabolismus, Lokalisierung des Vit. E im Körper Darm → Lymph → Blut → Leber → Blut →.... Absorption: Hydrophop ⇒ Spez. Transportmechanismen im wässrigen Milieu nötig  Absorption im proximalen Teil des Darms in Chylomikronen (lipoprotein-partikel) durch die Bürstensaum-membran durch passive Diffusion an der Schleimhaut in die Lymphe.– Mit Gallensäuren werden in der Dünndarm-mukosa die freien Tocopherole & Tocotrienole gemeinsam mit Triglyzeriden, freiem & verestertem Cholesterol, Phospholipiden, Proteinen & Apolipoproteinen sowie fettlöslichen Vitaminen & Carotinoiden in Chylomikronen eingebaut. Aufnahme auch möglich durch HDL (High-Density-Lipoproteins) Transport & Verteilung:  Über die Lymph-bahnen gelangen die Chylomikronen in den Blutkreislauf. α-Tocopherol wird vorzugsweise von α-TTP (Transferprotein) in Blutkreislauf transportiert.  Metabolismus: Das fettlösliche Vitamin E wird zum wasserlöslichen Carboxyethyl hydroxychroman (CEHC) abgebaut & über die Niere ausgeschieden. Lokalisierung: in Membranen http://www.chm.bris.ac.uk/motm/vitaminE/membrane.gif
• Wirkung - Vitamin E Wirkung - Vitamin E (Hauptsächlich in Membranlipiden, Depotfetten & Lipoproteinen) Verhinderung der Lipidperoxidation  Verringert Risiko für Herzerkrankungen, Arteriosklerose & Krebs  Einfluss auf z. B. Cholesterinsynthese & Keimdrüsenfunktion *Jeder Form hat unterschiedliche Eigenschaften 
• Wie wird das antioxidative Potenzial des Vit. E beim Menschen gemessen? 1. Messung des antioxidativen Potentials in Nahrungsmittel, Plasma, Blut od Urin.  FRAP (Ferric-Ion Reducing Antioxidant Power)– is an antioxidant capacity assay that uses Trolox as a standard. – Trolox = water-soluble analog of vitamin E TEAC assays (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity):– measures the antioxidant capacity of a given substance, as compared to the standard, Trolox.  2. Messung von Veränderungen an Biomarkern:  DNA Oxidation  Protein Oxidation
• Analytik des Vit E.: Analyse-Methode, Probenvorbereitung, Durchführung Analytik des Vit E.: (Tocopherol) 1. Analyse: NP(normal phase)- /RP(reverse phase)-HPLC  mit Fluoreszenz-Detektor  GC (Gaschromatographie)  CE (Capillary Electrophoresis)⇒ MS-Kopplung zur Identifikation  2. Probenvorbereitung:  Wenn Vit. frei (in Matrix) vorliegt:a) Einfäche Verdünnung öliger Proben in org. Lösungsmittel (z. B. Hexane)b) Fest-/Flüssig-Flüssig Extraktion Wenn Vit. fest in Matrix gebunden– Extraktion nach Verseifungsreaktion   (+) - Matrixzersetzung & Entfernung allg. Fette        - Bessere Auflösung & Trennung   (–) - Vit. E instabil (⇒ Antioxidantien, Schutzgas, wenig Licht)        - Analyt  Verluste durch entstehende Seife   3. Durchführung: Vorbereitung der Probe: (0,5 g Probe + 0,1 g Ascorbinsäure + 5 mL Ethanol + 2 mL Wasser)    ↓Mischen, N2-Spüllung    ↓ Verseifung:(+ 0,5 mL KOH-Lösung (9 Mol)) – 3 Kritische Parameter: Temp: 60, 80, 100 °C, Dauer: 20, 40, 60 min, Menge an KOH: 1, 2, 3 mL    ↓Wasserbad, Evaporation bis trocken    ↓ Vorbereitung für HPLC analyse:(2 ml Ethanol + 2 mL n-hexane)    ↓Evaporation bis trocknen    ↓ (Rückstände + 5 mL n-Hexane)    ↓ NP-HPLC mit Fluoreszenz-Detektor – Silica-Säule (5 μm, 250 mm * 4,6 mm)– Mobile Phase: 97 % n-Hexane und 3 % 1,4-Dioxane – Flussrate: 2 mL/min 
• Wie wird die Schutzwirkung von Antioxidantien gegen solar-simuliertes Licht beurteilt? Beispiel von Vit. C oder E alleine und eine Kombination von C & E (Ergebnis?) Beurteilung von der Schutzwirkung von Antioxidantien gegen solar-simuliertes Licht: Hautrötung & Anzahl der durch Sonnenbrand geschädigten Zellen werden bestimmt Ergebnis von Vitamin C & E: Antioxidant Protection Factor war bei der Kombination von Vit. C + E (15:1) höher als bei Vit. C od. E alleine
• Spektroskopische HPLC-Detektoren Spektroskopische HPLC-Detektoren: Chromophore für UV-Detektor: Man bezeichnet Doppelbindungssysteme & andere Gruppen mit einer charakteristischen Elektronenbande als Chromophore. Bei Substanzen mit unbekannter Molekülstruktur kann das UV-Spektrum wertvolle Hinweise auf möglicherweise vorhandene Chromophore geben.

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