Molekulare Tierzucht (Fach) / Array Techniken, qu. PCR, Kandidatengene, Reproduktion (Lektion)

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• Analyse der mRNA-Transkription gibt Hinweise auf die Expression von Genen (wird ein Gen überhaupt transkribiert? wie stark, wann und wo wird ein Gen transkribiert?) --> Bei vielen Genen spezifisch für bestimmte Gewebe/Zellen und physiologische Stadien Probenmaterial für solche Analysen: i.d.R. cDNA, seltener RNA Hybridisierungsverfahren In-situ Lokalisation von Transkripten Northern-Blot Dot-Blot DNA-Array PCR-basierende Verfahren Differential Display Quantitative PCR
• In-situ Lokalisation von Transkripten Nachweis von Transkripten/ der Genexpression in Zell- oder Gewebepräparaten Anfertigung von Gewebe-Dünnschnitten (auf Objektträger/ Befreiung der RNA von Proteinen durch HCl + Proteinase) Hybridisierung mit markierter Sonde Visualisierung z.B. mit Autoradiographie
• Northern Blotting Prinzip: Isolierung von RNA-Molekülen aus einem Zelltyp/Gewebe Geleleltrophoretische Auftrennung Übertragung auf eine Membran (Immobilisierung; blotten) Hybridisierung mit markierter Sonde (= DNA- oder RNA- Fragment des Ziegels) Autoradiographie / Antikörper-Färbung --> Jede Bande kennzeichnet eine RNA-Art (mit komplementärer Sequenz zur Sonde), die in den Zellen transkribiert wurde Mehrere Banden: wenn mehrere Gene transkribiert werden, die zur Sonde komplementäre Sequenzen aufweisen oder wenn prä-mRNA untersch. gespleißt wird Hohe Bandenintensität= intensive Trankription der betreffenden RNA-Art Aber: teils Überlagerung gleich großer, aber verschiedener RNA-Arten und aufwendig wenn viele Gene und Gewebe untersucht werden sollen
• Hybridisierung von DNA/RNA mit der Sonde Prinzip: Prähybridisierung der Membran mit Puffer zur Blockade unspezifischer DNA-Bindung Zugabe der Sonde im Hybridisierungspuffer Inkubation bei bestimmter Temperatur (ca. 25°C) Waschen mit Puffr -> hybridisierte Sondenmoleküle bleiben auf Träger
• Dot-Blot RNA wird ohne vorherige Elektrophorese punktförmig ("dot") auf Membran geblottet z.B. RNA aus versch. Gewebe auf eine Membran und Verwendung genspezifischer Sonden: Hybridisierungssignal ja/nein? Aussage darüber in welchem Gewebe die getestete RNA vorkommt, das entsprechende Gen exprimiert wird Auftragung versch. Verdünnungsstufen auf die Membran Signalstärken geben Rückschluss auf RNA-Menge in Probe Dots auch bei DNA-Arrays -> pro Ansatz viele Gene untersuchbar
• DNA-Arrays Anordnung einzelner Dot-Blot-Testfelder (100-1Mio) auf einem Träger (=Array, Chip) auf Array sind (genspezifische) Sonden immobilisiert, i.d.R. pro Feld viele gleichartige DNA-Moleküle Sonden i.d.R. = kurze Oligonukleotide (ca. 25 bp) -> i.d.R. mehrere/Gen um Genspezifität zu erreichen Hybridisierung freier Fluorchrom-markierter Target-DNA an Sonden
• Hybridisierung von Target und Sonde prinzipieller Vorgang: Prähybridisierung des Trägers mit Puffer zur Blockade unspezifischer DNA-Bindung Zugabe eines Targets um Hybridisierungspuffer Inkbation bei bestimmter Temperatur (ca. 25° C unter Schmelztemperatur der DNA-Doppelhelix) Waschen mit Puffer -> nur hybridisierte DNA bleibt auf Träger verschiedene Techniken (Automatisierung) markierte Targetmoleküle werden in solchen Testfeldern immobilisiert, in denen die Sonde über komplementäre Sequenzen verfügt Signale werden in jedem einzelnen Feld des Arrays gemessen
• Signaldetektion und Datenanalyse i.d.R. Fluorochrom-Markierung Detektion der Singale mit Laserscanner, Kamera, Massenspektrometrie schnell, Quantifizierung der Signale möglich Identifizierung des Ortes der Hybridisierung und damit Identifizierung des Gens Datenauswertung mit spezieller Software enorme Datenmengen, Auswertung abhängig vom Experiment immer notwendig: Hintergrund.Subtraktion (entfernt unspezifische Hintergrundstörungen)
• Einsatz von DNA-Arrays für Transkriptionsanalysen Möglichkeit, die Transkription vieler Gene gleichzeitig zu messen (vgl. andere Methoden: nur ein bis wenige Gen/e) Ermittlung der relativen Gen-Transkription möglich = Expressionsunterschiede!!
• Nicht verwechseln: DNA-Arrays.... DNA-Chips (SNP-Chips): zur Genotypisierung von DNA-Varianten Nutzung genomischer DNA für genomische Selektion für Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) für Untersuchungen zur Diversität von Rassen etc. oder Transkriptionsarrays: zur Analyse der Transkription/Expression von Genen Nutzung von RNA oder cDNA Zum Vergleich der Transkription (ja,Nein,Menge) von Genen z.B. zwischen Tieren mit versch. Merkmalsauspräung zur Phönotypisierung und/oder Identifizierung funktionaler Gene
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• Kandidatengenansatz Kandidatengen= Gen, das potenziell die Ausprägung des betrachteten Merkmals beeinflusst Fuktion der Gene aus anderen Untersuchungen oder Spezies bekannt --> Funktionelle Kandidatengene Verwendung von cDNA Bibliotheken zur Identifizierung von gewebsspezifisch exprimierten Genen Position aus vergleichenden Kartierungen bekannt Zwischen verwandten Spezies häufig ähnliche Anordnungen der Loci --> Positionelle Kandidatengene Vorgehen: Positionale Kandidatengene: Vorherige QTL-Untersuchung --> QTL gefunden; Suche nach Kandidatengen innerhalb dieses QTLs Funktionale Kandidatengene: Untersuchung "verdächtiger" Gene, ausgehend von der Funktion der Gene (z.B. Krankheit xy --> Kandidatengene mit Funktion in Immunabwehr)
• Biotechnologie Definition: Anwendung technologischer Verfahren auf Tiere mit dem Ziel der Beeinflussung der direkten oder indirekten Leistungsmerkmale. Biotechnologien sind seit Beginn der Tierhaltung durch den Menschen essentieller Bestandteil der Tierzucht (z.B. Kastration)
• Biotechnologien in der heutigen Tierzucht Reproduktionsbiotechnologien: Künstliche Besamung (KB) Embryo Transfer (ET) Ovum Pick Up (OPU) und in Vitro Fertilisation (IVF) Sperma-Sexing Klonierung Molekulargenetische Methoden: markergestützte Selektion (MAS) genomische Selektion (GS)
• Künstliche Besamung Instrumentelle Gewinnung Konservierung Portionierung Übertragung von Spermien Vorteile: Seuchenhygiene Wirtschaftliche Gründe (Kostensenkung, Risikominderung, Flexibilität beim Vatereinsatz, Vereinfachte betriebliche Organisation) Züchterische Gründe ( Zeitlich unabhängige Verwendung von Vatertieren, Überregionale Nutzung, hohe Zuchtwertschätzung, Hohe Selektionsintensität, Verringerung des Generationsintervalls) Risiken: Steigerung der Inzucht Verbreitung unerwünschter Erbanlagen
• Gesextes Sperma Größenunterschied zwischen X und Y Chromosomen --> Y ist kleiner und hat weniger DNA Unterschied im Chromatingehalt beträgt beim Rind 3,8% Anfärbung der Spermien mit Fluoreszensfarbstoff Unterschied in der Intensität je nach DNA Gehalt der Spermien Hochgeschwindigkeits Flowzytometrie: 20 Milionen Spermien pro Stunde -> 10 Portionen Spermienbeweglichkeit wird deutlich reduziert Vorteile: 85-90% X-Chromosomen in der Portion Geringere Tot- und Schwergeburtenrate Höhere Anzahl weiblicher Kälber erhöht den Zuchtfortschritt auf der weiblichen Seite Nachteile: Höherer Aufwand, höhere Kosten Pro Portion nur 2 Mio Spermien (statt 20 Mio) Geringere Trächtigkeitsraten
• Kryokonservierung Halbarmachung von lebenden Körperzellen Embryonen oder Gameten durch tiefe Temperaturen und über lange Zeiträume Erst bei Temperaturen von -80°C bis -196°C Stillstand der Stoffwechselvorgänge
• Einflussfaktoren auf Kryokonservierung Zelltyp: Stadium der Embryonalentwicklung; Gewebeherkunft der Zellen; Spezies bzw. auch verschiende Tiere der gleichen Spezies Volumetrischer Zellanteil in der Suspension: Beeinflussung der Zell-Zell bzw. Zell-Eiskristall-Wechselwirkungen; optimale Überlebensraten --> genügend hohe Zelldichten erforderlich Osmolarität der Lösung: beeinflusst Anschwellen (hypotone Lösungen) oder Schrumpfen (hypertone Lösungen) der Zellen; günstig: Zellen gehen vor dem Einfrieren Wasser ab, unterschreiten aber nicht Minimalvolumen Eiskristallbildung: Begrenzung der Eiskristalle durch hohe Viskosität der Lösung und rasche Abkühlraten Art und Zusammensetzung der Einriermedien: Kryoprotektiva (Gefrierschutzmittel) unterstützen einen schonenden Gefrierprozess Ziel: Optimierung der verschiedenen Parameter für maximalen Erfolg
• Probleme bei Kryokonservierung Zellschädigungen beim Gefrieren und Auftauen: Wasserabgabe aus Zellen bei langsamer Abkühlung und intrazelluläre Eiskristallbildung bei schneller Abkühlung ultraschnelle Abkühlung: kaum Schädigung Vitrifikation = Festwerden einer Flüssigkeit durch Erhöhung der Viskosität ohne Kristallbildung
• Embryotransfer Verfahren zur: Gewinnung von Embryonen eines weiblichen Tieres (Spender) und Übertragung auf Empfängertiere (hauptsächliche Bedeutung beim Rind) Vorteile: Zahlreiche Nachkommen von wertvollem weibl. Tier (5 Kälber vs. bis zu 100 Kälber) Nachkommen frei von Krankheiten (SPF) Nachkommen von (sonst) nicht mehr fertilen Tieren Frühzeitige Nutzung von weiblichen Tieren -> Zucht Langzeitkonservierung (Genreserven) Globae Ausbreitung Nachteile: Effizienz der Methoden und Ergebnisse noch verbesserungswürdig (hohe Kosten, geringer Anteil transfertauglicher Embryonen) Trächtigkeitsraten sinken vor allem bei konservierten Embryonen Zunahme der Inzucht
• Schritte des ET Auswahl von Spender- und Empfängertieren Superovulation Besamung und Embryonengewinnung Embryobeurteilung In-vito Kultivierung und Konservierung von Embryonen Transfer von Embryonen
• In-vitro Produktion Was ist IVP? In-vitro Fertilisation (IVF): Befruchtung von Eizellen außerhalb des mütterlichen Organismus Nutztiere: Umfassender Begriff: In-vitro Produktion (IVP) Anwendung vor allem beim Rind
• Schritte der in-vitro Produktion Eizellgewinnung Selektion der Eizellene In-vitro-Maturation (IVM) In-vitro-Kapazitation In-vitro-Fertilisation (IVF) Kultivierung der IVF-Embryonen
• Was ist ein Klon? Individuen, Zellenm, Viren oder DNA-Moleküle, die aus einem gemeinsamen Ahnen (Ursprung) hervorgegangen sind Erbinformationen identisch Synonym: Klonierung Tiere: Klonen = asexuelle Vermehrung
• Was unterscheidet Mehrlinge und Klone? Mehrlinge: monozygot: eineiig (Teilung des Embryos) di-/oligozygot: zweeiig (multiple Ovulationen) Klone: durch Embryosplitting durch Kerntransfer
• Klonen aus genetischer Sicht Bei der Herstellung identischer Kopien eines Tieres kann die individuelle genetische Veranlagung des Tieres voll genutzt werden der ganze Genotyp wird vermehrt: nicht nur die Hälfte der Gene wird weitergegeben zusätzlich: spezielle Passereffekte können wiederholbar genutzt werden Klonmitglieder sind aber trotzdem nicht völlig identish: Z.B. zytoplasmatische Effekte
• Reproduktives Klonen - Verfahren: Embryosplitting/ Mikrochirurgische Teilung Isolierung und Proliferation von embryonalen Zellen Kerntransfer
• Prinzip Kerntransfer (Beispiel: Embryonale Zellen) Vorbereitung der Empfänger-Oozyte: in der Metaphase II werden die Chromosomen und Polkörper entfernt --> Enucleation Eine Spenderblastomere wird aus einem Embryo entnommen Die Zelle wird in den Raum zwischen Zona pellucida und Cytoplamsa der Empfängeroocyte eingesetzt Mit elektrischen Impulsen werden Plasmamembranen an den Berührungsstellen desintegriert, dadurch Aufnahme des Zellkerns in das Zytoplasma Spenderzellkern wird zur Teilung aktiviert und schwillt an Weitere Prozesse gesteuert durch Faktoren im Cytoplasma führen zu einer Rückprogrammierung des Spenderzellkerns auf das Stadium eines Zygotenzellkerns und bewirken die Entwicklung bis zum Blastocystenstadium Embryotransfer

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