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Molekulare Tierzucht (Fach) / Organisation und Struktur von Genen (Lektion)
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- Postgenomische Ära "Phase, in der sich die Lebenswissenschaften befinden, seit es Anfang der neunzuger Jahre des 20. Jahrhunderts gelang, über einzelne Chromosomenabschnitte hinaus ganze Chromosomensätze vollständig zu sequenzieren." Im Mittelpunkt des Interesses steht die Funktionsweise der Gene Hauptziel ist die Erfassung aller funktionellen Bereiche des Genoms und des Transkriptoms Ebenen der Forschung: Metaboliten Proteine mRNA DNA
- Organisation und Struktur von Genen Start-Codon = Translations-Start = Codon, dass für die 1. AS codiert (i.d.R. "AUG") Stop-Codon = Translations-Stopp = Ende des Proteins; UAA, UAG oder UGA ORF (open reading frame) = offener Leserahmen = Start-Codon bis Stop-Codon ORF wird flankiert von 5`-UTR und 3`-UTR UTR = "untranslated region" = Teile von Exons, die in mRNA transkribiert aber nicht in Protein translatiert werden
- Spleißen der prä-mRNA Durch einen Multienzym-Komplex (Spleiceosom), das spezifische Sequenzen erkennt Spleiß-Donorseite Spleiß-Akzeptorseite Branch-Seite Zeitlich beim Export der RNA aus dem Zellkern in das Cytoplasma der Zelle Mutationen in den Spleiß-Erkennungsstellen können zum "Ausschalten/Überspringen" einzelner Exons -> Exonskipping Einführen neuer Exons -> Exonshuffling führen. --> Enstehen möglicher Gen-Funktionen
- Organisation eukaryotischer Promotoren wichtig für Zeitpunkt und Intensität der Transkription geordneter Abruf der genetischen Info transcription starting point, tsp Base, die als erste in mRNA kopiert wrd =Position + I kein einheitliches Sequenzmotiv DNA-Sequenzmotive für Transkriptopnsfaktoren (z.B. TATA-Box)
- Isolation von Gesamt-RNA Gesamt-RNA = mRNA, tRNA, rRNA, microRNA von Intresse vor allem mRNA mRNA-Isolation nur möglich aus dem Gewebe in dem das Gen exprimiert wird z.B. k-Kasein: Eutergewebe, somat. Zellen, Milch Isolierung zum Beispiel: unter Verwendung von reversibel RNA-bindenden Materialien, z.B. Säulentechnologie Phenol-Chloroform-Isolierung
- Besonderheiten bei der RNA-Präparation RNasen (Ribonucleasen, Transferasen) -> Hydrolyse von RNA Vorkehrungen: Separate Geräte; Einmal-Plastikwaren (RNase-frei) oder "Backen" der Mehrweguntensilien bei 200° Inaktivierung von zellulären RNasen (durch flüssigen Stickstoff (-196°C); Zusatz von RNase-hemmenden Stoffen) Stabilisierung der RNA im Gewebe (Zugabe von z.B. RNAlater)
- Anreicherung von mRNA Bestandteile von Gesamt-RNA-Lösungen: 80% rRNA nur 2-5% mRNA mRNA (i.d.R.) am 3`-Ende polyadenyliert = 20-200 Adeninreste --> Bindung der mRNA an Trägermaterial mit Oligo(dT)-Molekülen
- cDNA-Synthese cDNA= coding-/ complementary-/copy-DNA cDNA-Synthese= reverse Transkription (RT) cDNA= RNase-stabil, archivierbar, sequenzierbar Mit Hilfe der Reversen Transkriptase (RTase; Enzym aus Retroviren) wird einzelsträngige MRNA in doppelsträngige DNA umkopiert Template für cDNA-Synthese: Gesamt-RNA (meistens) oder angereicherte mRNA
- Identifizierung von Konsensus-Sequenzen für Transkriptionsfaktoren In silico Analysen DNA/ Protein- Bindungsanalysen Band-Shift-Assay DNA-Footprinting Funktionsprüfung im zellfreien Extrakt= in vitro-Transkription in transgenen Zellen oder Tieren = in vivo-Transkription
- Band-Shift-Assay = Electrophoretic-Mobility-Shift-Assay (EMSA) Shift= verschieben Prinzip: Nachweis der DNA/Proteinbindung durch Veränderung der eletrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit im Verlgleich zum ungebundenen Zustand "Zutaten": doppelsträngiges markiertes DNA-Fragment mit potenziellem Bindungsmotiv (20-50bp) spezielle DNA-bindende Proteine (aus Gesamt-Kernextrakt oder einzelne isolierte Transkriptionsfaktoren) native= nicht denaturierte Elektrophorese (PAGE)
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- Super-Shift-Assay Nachweis, dass ein bestimmtes Protein an DNA gebunden hat (-> wichtig bei Verwendung von Kernextrakten mit mehreren Proteinen) Antikkörper (erkennt spezifisch den zu untersuchenden Transkriptionsfaktor (hier PI) DNA/Protein-Komplex wird noch größer -> SUPER-SHIFT