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Bioreaktortechnik (Fach) / VL 16 (Lektion)

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• Man hat verschiedene Reagenzgläser mit Medium. Darüber ist Sauerstoff. Wo findet man Zellwachstum, wenn es sich bei den MOs um a) obligat aerob b) anaerob c) fakultativ aerob d) mikroaeropil e) aerotolerant handelt? a)Obliga aerobWachstum nur oben. Die Zellen nehmen den Sauerstoff auf und es steht den unteren nicht mehr zur Verfügung. Durch Diffusion gelangt etwas Sauerstoff in den Agar, daher nimmt die Konzentration der Zelldichte nach unten hin ab. b)AnaerobWachstum nur unten, wo kein Sauerstoff durch Diffusion hinkommt. c)Fakultativ aerobWachstum überall, allerdings wird Sauerstoff bevorzugt, daher ist oben mehr Wachstum. Anaerober Stoffwechsel verbraucht mehr ATP, daher findet man unten weiniger MOs. d)MikroaerophilWeder kein Sauerstoff, noch viel Sauerstoff sind gut. Sauerstoff wird benötigt. Aber in reduzierter Konzentration. Wachstum dicht unter der oberen Schicht. e)AerotolerantMOs brauchen/nutze keinen Sauerstoff, aber die Gegenwart macht ihnen nichts. Überall Wachstum.
• Was tut ein MO, wenn es zur Sauerstofflimitation kommt? Nenne 5 Möglichkeiten 1.Der gesamte Metabolismus verlangsamt sich ohne irgendwelche weiteren (biochemischen) Konsequenzen. Der MO nimmt den Sauerstoff, den er bekommt. 2.Bildung von Säure und Alkohol verschlechtert die Umweltbedingungen des Mikroorganismus. Glucose wird in die Zelle geschleust, aber im Citratzyklus nicht abgebaut. NADH samelt sich. Es wird Lactat gebildet. Ansäuerung und die Bildung von Ethanol führt schließlich zum Tod. 3.Der Mikroorganismus reagiert mit weniger Produktbildung und zeigt ein enges Optimum. 4.Der Mikroorganismus verändert komplett seinen Metaboliusmus, z.B. Anschalten neuer Wege. 5.Der Mikroorganismus stirbt.
• Zeichne/Beschreibe und erkläre den Einfluss von Stromstörern in Schüttelkolben auf a) die Bildung eines Produktes, was unter anaeroben Bedingungen gebildet wird (Asparaginase) b) die Sauerstoffkonzentration in der Flüssigkeit c) die Bildung eines Produktes, was unter aeroben Bedingungen gebildet wird (Antibiotika) StromgestörtIst das System stromgestört, so ist die Oberfläche unruhiger und welliger. Das bedeutet, die Oberfläche ist größer und somit kann mehr Sauerstoff eingetragen werden. Daher ist die ganze Zeit über Sauerstoff gelöst und wird nicht aufgebraucht. Die Prodigiosinkonzentration steigt, also ist die Produktion von Sauerstoff abhängig. Asparaginase dagegen wird kaum gebildet. Sie wird wahrscheinlich nur bei geringer/keiner Sauerstoffkonzentration bevorzugt gebildet. Nicht stromgestörtIst das System nicht stromgestört, so wird weniger Sauerstoff eingetragen. Die Sauerstoffzufuhr reicht nicht aus und es wird zu einem sauerstofflimitierten System. Da nur wenig Sauerstoff vorhanden ist, wird mehr Asparaginase gebildet. Prodigiosin dagegen wird nicht gebildet.
• Beschreibe den Sauerstofftransfer von der Gasblase zum MO  Kern der Gasphase (Konzentration konstant) Gasseitige Grenzfläche (zu vernachlässigende Abnahme der Konzentration) Phasengrenzfläche (PG) gas/flüssig (geringer Konzentrationssprung) Diffusion durch die relativ undurchmischte flüssigkeitsseitigeGrenzfläche in den Kern der Flüssigkeit => limitierender Schritt Kern der Flüssigphase aus dem Kern der Flüssigphase an die Oberfläche der Biophase gekoppelte Diffusion und Reaktion im Inneren der Biophase
• Wie funktioniert die stop flow Methode zur dynamischen kla Messung? Stop flow MethodeIdee:Begasung wird während der Fermentation ausgeschaltet. Die OUR (Sauerstoffaufnahmerate) kann aus dem Abfall des DOT (gelöster Sauerstoff) berechnet werden. Dann wird die Begasung wieder angeschaltet. Da die OUR bekannt ist, kann der kLa Wert  aus der Steigung des DOT-Signals berechnet werden.Problem:In aktiv atmenden Kulturen sinkt der DOT sehr schnell. Kleine Blasen haben keine Zeit die Fermentationsbrühe zu verlassen. Das bedeutet, dass der Massentransfer dieser kleinen Blasen weiterhin stattfindet und der OUR ist falsch. Die Messgenauigkeit ist sehr gering. Die Methode ist nicht empfehlenswert.
• Erkläre die Gassing-Out Methode zur kla Bestimmung? Idee:Steriles Medium wird mit Luft begast. Dann wird die Begasung auf Stickstoff umgestellt, so dass der Sauerstoff entfernt wird. Der kLa-Wert kann aus dem zeitlichen Verlauf des DOT-Signals berechnet werden.Problem:Der Stickstoff nimmt Sauerstoff aus der Flüssigkeit auf. Daher ist die Konzentration d Gasphase unbekannt und der laufende Gradient undefiniert. Diese Methode ist nicht bei hohen kLa-Werten nicht zu verwenden.
• Erkläre die Sulfit Oxidation Methode zur kla Bestimmung Idee:Eine wässrige Salzlösung mit einer Ionenstärke, die der des zu fermentierenden Mediums entspricht, wird begast. Co2+ wird als Katalysator dazugegeben. Der DOT ist bei 100% Luftsättigung. Sulfit-Medium mit einer definierten Konzentration wird dazugegeben. Sulfit wird zu Sulfat oxidiert, woraufhin der DOT auf 0% sinkt. Das ganze Sulfit ist aufgebraucht, wenn das DOT-Signal wieder steigt. Der kLa kann aus der Stöchiometrie der Sulfitoxidation und der Zeit mit zu Aufbrauch des Sulfits berechnet werden.Problem:Diese Methode wird in einer Modelllösung ausgeführt, die etwas anders als das Medium ist.
• Erkläre die Pressure step Methode zur kla Bestimmung Idee:Steriles Medium oder eine biologisch aktive Fermentationsbrühe wird begast. Dann wird der Druck im Kopfraum des Fermenters um 0,2 bar erhöht. Der kLa-Wert kann dann aus dem zeitlichen Verlauf des DOT-Signales berechnet wird.Vorteil:Der Sauerstoffpartialdruck steigt in allen Blasen gleich. Somit ist der laufende Konzentrationsgradient genau definiert. Der Blasendurchmesser steigt etwas, während der gas hold-p sich nicht sehr ändern. Scheint die beste Methode zu sein.
• Welche Methode der kla Wert Bestimmung ist die genauste? Die stationäre Methode mittels Abgasanalyse ist die genaueste und sollte wenn möglich verwendet werden.
• Wie sieht die Löslichkeit eines Gases in Wasser in Abhängigkeit von der Temperatur aus? Was ist besser in Wasser löslich: CO2 oder O2? Die Löslichkeit von Gas sinkt bei Erhöhung der Temperatur. CO2 ist in Wasser besser löslich als Sauerstoff oder Stickstoff.
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• Abhängigkeit der Sauerstofflöslichkeit von der Konzentration von Salzen und Zuckern Mit steigender Salzkonzentration nimmt die Löslichkeit ab Je höher die Konzentration der gelösten Zucker, desto niedriger ist dieSauerstofflöslichkeit
• Wodurch wird die Abnahme des OTR bei Zugabe von Salzen beeinflusst? - kL-Wert: Mit zunehmender Salzkonzentration nimmt der relative Diffusionskoeffizient ab - a: Durch Koaleszenzhemmung bei Erhöhung der Ionenstärke nimmt die Phasengrenzfläche anfangs zu, bis zu dem kritischen Wert von 0,4 mol/L bei dem das System vollständig Koaleszenzgehemmt ist. Ab diesem Wert bleibt a konstant. - Der kla Wert steigt demnach zu Anfang und sinkt nach dem kritischen Wert - Die Löslichkeit nimmt durch Zunahme der gelösten Stoffe im System ab -Kombiniert man diese Verläufe erhält man die Beeinflussung des OTR
• Wird das Wachstum von MOs von verschiedenen Zusatzstoffen beeinflusst? Die optische Dichte sinkt bei Zugabe von Zusatzstoffen, wie Zucker oder Salzen. Das liegt daran, dass weniger Sauerstoff gelöst werden kann und die MOs somit weniger Sauerstoff zur Verfügung haben. 
• Wie können aerobe Bakterien bei sehr hohen Temperaturen (Thermophile) existieren?  OTR ist proportional zur Löslichkeit und zum kLa-Wert kLa-Wert steigt (steigender Diffusionskoeffizient mit steigender Temperatur) mitZunahme der Temperatur, die Löslichkeit hingegen nimmt ab Der eine Effekt wirkt sich positiv auf die OTR aus, der andere hat einennegativen Einfluss Die beiden gegenläufigen Effekte gleichen sich aus, sodass sich die OTR mitsteigender Temperatur kaum verändert, bzw. sogar leicht zunimmt
• Wie unterscheidet sich der kla Wert der untersten Rührstufe zu den anderen? kLa der untersten Stufe am geringsten, da Leistungseintrag der untersten Stufeam geringsten (ca 40% geringer)
• Wie wirkt sich eine Druckerhöhung (z.B. durch ein zum Teil verschlossenes Abluftventil oder Schaum im Abluftfilter) auf die 1) OTR 2) Gasleerrohrgeschwindigkeit 3) P/V (Expansion) 4) P/V Rührer 5) yO2* aus? 1) der absolute Druck steigt an, dadurch steigt die OTR (ist proportional zumDruck)2) ug(Gasleerrohrgeschwindigkeit) sinkt: Pressluft geht mit einem bestimmtenDruck durch das Ventil rein, wenn diesem Druck ein erhöhter Innendruck imFermenter gegenübersteht, geht insgesamt weniger bzw. schwieriger Luft rein(Annahme: kein Regler am Zulauf, der gegensteuert) wenn ug sinkt, sinkt der kLa-Wert und damit auch die OTR3) (P/V)Expansion Leistung, die durch die Gasexpansion eingetragen wird, sinkt,wenn die Begasungsrate abnimmt (nur in großen Fermentern wichtig)4) (P/V)Rührer steigt an, denn je geringer die Begasung, desto höher ist derLeistungseintrag (Leistungseintrag sinkt bei Begasung)5) y*O2: bei gleichem Verbrauch sinkt der Anteil in der Flüssigkeit an derPhasengrenzfläche, da insgesamt weniger Gas den Reaktor durchströmt treibendes Konzentrationsgefälle sinkt
• Welche Faktoren beeinflussen den Sauerstofftransport, bzw. die Sauerstoffversorgung? Nenne 5 1)Leistungseintrag (durch Rühren und Gasexpansion), Einfluss auf den kL- und a-Wert durch Generierung kleinerer Blasen 2)Veränderung im gas hold-up und dadurch auch der Massentransferbereich durch die Gasgeschwindigkeit 3)Abfall der Sauerstoffkonzentration in Blasen auf dem Weg durch den Reaktor 4)Sauerstoffkonzentration des Einlassgases 5)Druck (im Kopfraum, hydrostatischer Druck) 6)Temperatur (Beeinflusst durch den Diffusionskoeffizient, Löslichkeit, …) 7)Veränderung der Koaleszenz, charakterisiert die Fermentationsbrühe durch Bildung von Produkten 8)Einfluss von grenzflächenaktiver Stoffe und Antischaum mittel auf den kLa-Wert (kL-Werte werden normalerweise kleiner, a-Werte größer) 9)Veränderung der Sauerstofflöslichkeit durch Substratverbrauch oder Produktbildung 10)Veränderung des effektiven Diffusionskoeffizienten durch Substratverbrauch oder Produktbildung 11)Erhöhung der Viskosität durch Anreicherung von (filamentösen) Zellen oder polymeren Produkten 12)Bildung von schlecht durchmischten oder stagnierenden Zonen im Reaktor, wenn die Fermentationsbrühe eine nicht-newtonsche Flüssigkeit enthält 13)Bildung von Zellaggregaten und Pellets mit schlechter Versorgung in der Mitte 14)Vorhandensein von gelösten festen Partikeln (senkt den kLa-Wert bei Partikeln < 3mm, erhöht bei größeren Partikeln) 15)Vorhandensein einer zweiten (organischen) Phase mit einer höheren Sauerstofflöslichkeit
• CO2 hat Einfluss auf das GESAMTE Wachstum eines MOs. Wie sieht das aus? Was kann man daraus über die optimierte Führung eines Reaktors ableiten? Zu Beginn wird noch kein CO2 im Citrat-Zyklus gebildet • Stattdessen wird CO2 bei den anaplerotischen Reaktionen fixiert Am Anfang muss sich der Mikroorganismus erst einmal auf die veränderten Bedingungen einstellen (lag-Phase), deshalb sollte nur eine sehr geringe Begasungsrate eingestellt werden, damit noch ausreichend CO2 für die anaplerotischen Reaktionen zur Verfügung steht Falls der Reaktor schon zu Beginn mit hoher Begasungsrate betrieben wird, wird das CO2, das aus der Vorkultur miteingebracht wurde, gestrippt
• Was versteht man unter dem Begriff "Sauerstofftransferrate/Oxygen Transfer Rate" (OTR)? Wann kann eine OTR gemessen werden? Die OTR ist eine Stofftransferrate. Sie gibt daher die Menge an Sauerstoff an, die pro Zeiteinheit von der Gasphase in die Flüssigphase übertragen wird. Dabei wird die Menge an Sauerstoff molar und spezifisch (auf das vorliegende Flüssigkeitsvolumen bezogen) angegeben. Die Einheit der OTR beträgt mol/(L∙h). Ein Sauerstoffübergang kann nur dann beobachtet werden, wenn zwischen Gasphase und flüssiger Phase kein Sauerstoffgleichgewicht herrscht, sondern kontinuierlich Sauerstoff in die Flüssigkeit transportiert wird. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn die Mikroorganismen Sauerstoff aus der Flüssigkeit aufnehmen. Die OTR in einem Rührkesselreaktor kann beispielsweise durch Messung der Abgaskonzentration (O2, CO2) sowie des Eingangsvolumenstroms in den Reaktor bestimmt werden.
• Warum ist das Substrat Sauerstoff bei aeroben biologischen Prozessen häufig problematisch? Sauerstoff kann nicht wie beispielsweise Glucose vorgelegt werden. Da Sauerstoff nur sehr geringe Löslichkeit in Wasser besitzt, von den Mikroorganismen aber in den größten molaren Mengen verstoffwechselt wird, stellt die ausreichende Sauerstoffversorgung aerober Organismen häufig den Engpass eines biologischen Prozesses dar.
• Wie wird die OTR für die sich im Reaktorraum befindlichen Gasblasen definiert? Geben Sie die Gleichung an und benennen Sie die verwendeten Formelzeichen mit Namen und üblicher Einheit.  OTR = Sauerstofftransferrate [mol/(L*h)] kLa = volumenbezogener Sauerstoffübergangskoeffizient [s-1] cO2* = Sauerstoffkonzentration an der Gas/Flüssigphasengrenze [mol/L] cO2,L = Sauerstoffkonzentration in der Flüssigkeit [mol/L] LO2 = Sauerstofflöslichkeit [mol/L/bar] pabs = Absolutdruck [bar] yO2* = Sauerstoffmolenbruch im Gas an der Gas/Flüssigphasengrenze[mol/mol] yO2,L = Sauerstoffmolenbruch, welcher der in der Flüssigkeit gelöstenKonzentration entspricht [mol/mol]

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