LF11 - Mikrobiologie (Fach) / Zellkultur (Lektion)

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• Für was sind Glucose, Pyridoxin*HCl und Riboflavin in Kulturmedien enthalten? Glucose: als Kohlenstoff- und EnergiequellePyridoxin*HCl: verhindert Niederschläge in Flüssigem MediumRiboflavin: verhindert Photooxidation
• Wie ist das DMEM-Medium zusammengesetzt und warum sind die Bestandteile enthalten? Salze: für osmotischen Druck und pH-PufferungNa-Pyruvat: Zwischenprodukt vieler StoffwechselwegePhenolrot: Indikator->zeigt Zustand des Mediums anPuffer: Natriumhydrogencarbonat -> Haydrogencarbonat Puffert zusammen mit CO2Aminosäuren: Zugabe essentieller AS um nicht-essentielle AS herzustellen, Baustoffe für Eiweiße, Energielieferant, PufferCholinchlorid: Baustein für LecithinVitamineSerum: enthält Wachstumsfaktoren, Hormone, Adhäsionsmoleküle, Cytokine, Aminosäuren und Vitamine
• Was ist das Problem bei der Verwendung von Serum in Medien? Was sind Alternativen? Problem:- Naturprodukt mit schwnakender ZusammensetzungAlternativen:- NKS (=Neugeborenes Kälber Serum) oder Rinderserum -> enthält aber weniger Wachstumsfaktoren- Definiertes Serum- Serumersatz
• Wie sollten Temperatur, CO2-Gehalt und Luftfeuchtigkeit in einem Inkubator sein? Was ist das Problem und wie könnte es gelöst werden? Warum spricht man von einem offenen Puffersystem? Temperatur: 37°C (Säugerzellen), 28°C (Insektenzellen)CO2-Gehalt: 5-10%Luftfeuchtigkeit: 70-100%offenes Puffersystem: Hydrogencarbonat im Medium und CO2 aus der Luft bilden PuffersystemHCO3- ---(+H+)--> H2CO3 ----> H2O + CO2Problem: Kontaminationsgefahr durch Pilze und BakterienLösung: Kupfer/Edelstahl-Oberflächen, Hitzesterilisation bei 160-180°C, regelmäßiges putzen und sterilisieren
• Was sind Vor- und Nachteile bei der Verwendung von Krebszellen? Vorteile:                                                                           Nachteile:- unbegrenzt teilungsfähig                                              - veränderte Zellfunktionen- keine Apoptose                                                            -  können gesundheitsschädlich sein- reproduzierbare Ergebnisse                                         - keine Kontakthemmung- keine Wachstumsfaktoren nötig                                   - veränderter Genotyp- billiger                                                                           - andere Genexpression- kontaminationsfreier zu kultivieren                               - erhöhte Mutationsrate- schnelleres Wachstum- keine Kontakthemmung
• Was heißt Epithel? Wie werden Epithelzellen eingeteilt und was sind ihre Charakteristika? Epithel = Sammelbezeichnung für Deck- und DrüsengewebeEinteilung: morphologisch -> Zellform und anzahl der ZellschichtenCharakteristika: Ausbildung von Zell-Zell-Verbindungen untereinander und mit direkter Umgebung
• Wie sind Epithelien aufgebaut? Was ist die apikale und was die basale Seite? - besteht aus ein- oder mehrlagiger Zellschicht -> bedeckt alle inneren und äußeren Körperoberflächen- sind klar vom Bindegewebe abgegrenzt und haben keine Blutgefäße- apikale Seite = äußere Seite- basale Seite = dem Lumen/Innenraum zugewandte Seite -> hier sind Zellen über Basallamina mit darunter liegendem Gewebe verbunden
• Welche Epithelarten werden unterschieden und wo sind sie zu finden? Einschichtige Epithelien:- einschichtiges Plattenepithel: Mesothel, Lungenalveolen, Endothel, Bowmansche-kapsel,...- kubisches Epithel: proximale und distale Nierentubuli, Speicheldrüse, Gallengänge- Zylinderepithel: Magen-Darm-Schleimhaut, EileiterMehrreihige Epithelinen:- nicht alle Zellen erreichen die Oberfläche- Epithelien der Atemwege, Nebenhodenhänge, SamenleiterMehrschichtige Epithelien:- mehrschichtiges Plattenepithel: unverhornt in Bereichen die ständig befeuchtet sind (Mundhöhle, Speiseröhre, Analkanal, Vagina,...), verhornt in Bereichen die der Luft ausgesetzt sind- Übergagsepithel: Beschaffenheit hängt von Dehnungszustand ab -> in Harnwegen
• Welche zwei Bindegewebsarten werden unterschieden? lockeres und straffes Bindegewebe
• Welche Funktion hat das lockere Bindegewebe? Aus welchen Zellen ist es aufgebaut? Was ist der Unterschied zwischen Fibroblasten und Fibrocyten? Funktion:- "Lückenfüller"- umhüllt Nerven und Gefäße - dient als Stroma in allen Organen- hat Stützfunktion und ermöglicht Gewebeverschiebungen- dient als Fett- und WasserspeicherZellen:- freie Bindegewebszellen (Makrophagen, Leukocyten, Mastzellen,..)- FibroblastenFibroblasten:- produzieren Interzellularsubstanz- sind besonders in sich entwickelnden Zellen aktiv- können bei Verletzungen faserreiches Narbengewebe bilden- haben großes Cytoplasma, das kurze Zellfortsätze bilden kannFibrocyten:- ausgreifte Fibroblasten- durch weite Interzellularräume voneinander getrennt- deutlich reduziertere Stoffwechselaktivität als Fibroblasten- schmale, spindelförmige Gestalt, ohne Fortsätze
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• Welche Funktion hat straffes Bindegewebe? Wie ist es aufgebaut? Welche Funktion haben sie in der Zellkultur? Funktion:- hält mechanischer belastung stand- in harter Hirnhaut und in Kapsel der gelenke zu findenAufbau:- Interzellularsubstanz dominiert, Grundsubstanz ist reduziert, um den Kollagenfasern Platz zu machen- Kollagenfasern entweder parallel oder geflechtartig angeordnetin Zellkultur:- kontaminieren Primärkulturen -> wachsen in Nachbarschaft zu anderen Zellen -> überwuchern irgendwann die Kultur- als Fütterzellen und als Substrat zum besseren Anheften der Zellen
• Was ist charakteristisch für eine Primärzellkultur? Wie wird sie gewonnen und für was wird sie verwendet? Lebensdauer unter in-vitro Bedingungen begrenztHerstellung:- Ausgangsmaterial: Organe oder Gewebe (Pflanzen, Tiere, Menschen)zerkleinern -> enzymatischer Verdau -> Zellsieb -> Waschschritte -> Zellzählung -> Verdünnung -> IsolierungVerwendung:- Erforschung zellulärer Prozesse- Patientenstudien- Grundlagenforschung: Zellstoffwechsel, Metabolismus, Morphologie
• Was sind die Vor- und Nachteile einer Primärzellkultur? Vorteile:- am wenigsten veränderte Zellen- Analysen generationsübergreifender Effekte- Feststellung von Differenzierungsvorgängen- behalten in-vitro meist ihre Eigenschaften und Charakteristika- Verwendung für Genanalysen auf Expressionsebene- besseres Verständnis für zelluläre Antworten in physiologischem Zusammenhang- ersetzt Tierversuch- breite Palette an GewebenNachteile:- Fibroblasten können Kultur überwuchern- Gewinnung abhängig von OP-Plan- potentiell infektiös- Zeit- und Arbeitsaufwendig- Morphologie und Stoffwechsel von Herkunft abhängig -> keine Vergleichbarkeit- zeitlich begrenzte Lebensdauer
• Wie werden adhärente primäre Zellkulturen aus Flüssigkeiten und aus Gewebe hergestellt? aus Flüssigkeiten:- Zellen durch Zentrifugation gewonnenaus Geweben:- Gewebe zerkleinern oder enzymatisch verdauen- Zellen waschen- nach Verdau wird erhaltene Zellsuspension zentrifugiert und die Zwllen anschließend gewaschen, um Enzymreste zu entfernen- Zellsuspension wird verdünnt und anschließend ausgesät
• Wie werden primäre Suspensionskulturen hergestellt? - Proben aus Körperflüssigkeiten zenrifugiert und die Zellen so isoliert -> Zellen auf Grund ihrer unterschiedlichen Dichte identifiziert- manche Zellen müssen vor Kultivierung zur Teilung angeregt werden z.B. Lymphocyten
• Was ist eine permanente Zellkultur? Welche permanenten Zellkulturen gibt es und wie werden sie hergestellt? permanente Zellkultur = Dauerkultur aus transformierten ZellenTumorzellen:- aus einem Tumor isoliert und als Zelllinie etabliertstabil transfizierte Zellen:- transformierter Phänotyp in-virto durch genetischen Eingriff erzeugt z.B. mit Viren- weitere Methode sind alkylierende Substanzen oder Strahlung -> Transformation ist zufälligTransfektion mit Telomerase:- werden durch Telomerase unsterblich gemacht
• Welche positiven und negativen Eigenschaften haben permanente Zellkulturen? positive Eigenschaften:- können Fähigkeit erlangen, ohne Substratkontakt zu wachsen- benötigen weniger Wachstumsfaktoren- unbegrenztes Teilungspotential- Verlust der Apoptose- Tumorzellen wachsen auf Weichagar- nicht zwingend maligne- ständig verfügbarnegative Eigenschaften:- veränderte Morphologie, als normaler Zelltyp- können Adhärenz und Kontaktinhibition verlieren- haben nur nch wenige ihrer ursprünglichen in-vivo Charakteristika- keine absolute Konstanz der Eigenschaften- junge Tumorzelllinie kann eine Mischpopulation aufweisen
• Welche Unterschiede haben adhärente Zellkulturen und Suspensionskulturen? adhärente Zellen:- wachsen auf Oberflächen- wachsen als Monolayer oder als Multilayer- müssen zur Herstellung einer Subkultur vim Substrat abgelöst werden- leiten sich von Geweben ab, die in-vivo nicht beweglich sind- zeigen eine zelldichteabhängige ProliferationshemmungSuspensionszellen:- wachsen in Suspension- wachsen als Einzelzellsuspension oder in Zellklümpchen- heften sich an Oberflächen- leiten sich von in-vivo frei zirkulierenden Zellen ab- keine Kontaktinhibition
• Was sind h-TERT-immortalisierte Zellen? - Zellen die mit katalytisch aktivem Teil der Telomerase transfiziert wurden- h-TERT = human Telomerase Reverse Transkriptase-> unsterbliche, auf lange Zeit stabilde, aber normale Zellline
• Welche Charakteristika haben h-TERT Zellen? - stabile Zelllinie, theoretisch unbegrenzte Lebensdauer- keine Seneszenz- Erhalt der Kontakthemmung- Zellzyklusarrest bei Serumhunger- aktibe exogene Exression der Telomerase- Erhalt primärer Zellmorphologie- normaler Karyotyp- wachsen nicht auf Weichagar- normale Zellantwort auf Zellzyklus- und Spindelapparatinhibitoren
• Welche Vor- und Nachteile haben h-TERT- Zellen? Vorteile:- Alternative für Anwender, die mit einer normalen aber permanenten Zelllinie arbeiten wollen- Alternative zu primären und transformierten Zellen- langfristige biochemische und physiologische Untersuchung des Zellwachstums möglichNachteile:- bei Fibroblastenzelllinien verlangsamtes Wachstum nach Hayflick-Limit und keine konstante Zellteilungsrate- bei Retinaepithelzellen werden Mutationen des Erbguts nicht verhindert
• Welche Arten von Kontaminationen gibt es? Was sind ihre Ursachen und wie lassen sie ich bekämpfen? tierische Zellen:- durch unreine Ausgangskultur- entsorgen oder spezielle Medien bei der KultivierungHefe-/Pilz-Zellen:- durch Brutschränke, Wasserbäder und Personal- entsorgen, Desinfektion, AntimycotikaBakterien:- durch Serum, Herstellung und Personal- entsorgen, AntibiotikaMycoplasmen:- durch Serum, bei der Herstellung und Personal- entsorgen, AntibiotikaViren:- durch Rinderserum, Trypsin und Personal- entsorgen
• Wie muss die Arbeit an der Sterilbank vorbereitet werden? Wie muss daran gearbeitet werden? Wie muss die Arbeit beendet werden? Vorbereitung:- Hände waschen und desinfizieren- UV-Licht anschalten- Sterilbank vor der Arbeit ein Paar Minuten laufen lassen- Handschuhe anziehen und diese dann desinfizieren- Scheibe öffnen und Arbeitsfläche desinfizieren- steriles Arbeitsmaterial verwendenArbeiten:- nicht über offene Gefäße langen- keine Deckel ablegen- sterile Pipetten über Luftzug öffnen und ins Innere der Werkbank ziehen- Materialien nebeneinander und nicht hintereinander stellen- mittig arbeiten- möglichst wenig Materialien unter der WerkbankEnde der Arbeit:- Materialien heraus nehmen- Bank desinfizieren und die Scheibe schließen- Handschuhe ausziehen- UV-Licht anschalten- Hände desinfizieren und anschließend waschen
• Was muss beim einfrieren und auftauen von Zellen beachtet werden? Einfrieren:- Zusatz von Gefrierschutzmitteln: DMSO, Glycerin - Zellen langsam einfrieren: 1°C/Minute -> im Isopropanolbehälter im Gefrierschrank- geeignete Gefäße für Stickstofflager verwendenAuftauen:- Zellen schnell auftauen- Zellen so schnell wie möglich mit frischem Medium verdünnen, um Gefrierschutzmittel loszuwerden
• Was bedeuten die Angaben T-25, T-75 usw. Wie hoch sollte das Medium sein? T-25 bzw T-75 gibt die Fläche der Zellkulturflasche in cm2 anMediumhöhe: 2-5 mm
• Wie werden adhärente Zellen passagiert? - Erwärmen der Trypsin/EDTA-Lösung, PBS und Medium auf 37°C- Beurteilung der Zellen unter dem Mikroskop- Absaugen des alten Mediums, Zellen waschen mit PBS, Absaugen der Waschlösung- Trypsin auf die Zellen geben und vereilen -> sobald 90% der Zellen abgerundet sind, Trypsin bis auf wenige Tropfen absaugen und 2-5 Minuten in den Inkubator stellen- Flasche vorsichtig gegen die Handfläche kopfen -> Zellen lösen sich- Medium dazu geben um Enzymaktivität zu stoppen- Zellen verdünnen und auf neue Flaschen aufteilen- Flaschen beschriften

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