Detergenzien (hier SDS)Auflösung von Biomembranen◦ Trennung der Nukleinsäure-Histon Bindung◦ Denaturierung der Proteine➢ liegen entfaltet in länglicher, gestreckter Form vor➢ Zerstörung von Lipiden im Zellpellet ...
TRIS-HCl-Puffer (pH 8,0)DNA wird im sauren protoniert → liegt ungeladen vor➢ die Phenol-Chloroform-Extraktion erfolgt in organischer Phase➢ daher ungeladene DNA schlecht➢ keine Trennung möglich◦ pH-Wert muss > 7,8 ...
EDTAdient der Komplexierung bivalente Ionen (v.a. Mg2+)◦ Magnesium = Cofaktor für Ribonuclease / Desoxyribonuklease➢ durch Komplexierung von Mg2+ → Inaktivierung der Nukleasen → Stabilisierung der ...
• NaClErhöht die Ionenstärke → Abbau der Hydrathülle der Proteine → gelangen so in die organische Phase◦ dient der Isotonisierung➢ Ursache: Zellen sollen nicht unkontrolliert platzen → DNA könnte ...
• Saccharose (Sorbit, Manit)Funktion als Osmotikum◦ Verhinderung der Schwellung und des Platzens von Organellen (z.B. Mitochondrien, Chloroplasten)◦ Vorteil von Sorbit, Manit: nur geringfügige Verarbeitung im Zellstoffwechsel ...
• spezielle Inhibitoren, StabilisatorenSchutz vor Proteasen → Erhaltung von Struktur und Aktivität vieler Enzyme◦ Inhibitoren:➢ z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Aprotinin, Pepstatin A◦ Stabilisatoren:➢ dienen der Erhaltung ...
TPA (tissue Plasminogen Activator)= eine Gensequenz aus 30.000 bp (kann LINE + SINE enthalten)• codiert ein Enzym, das von den Endothelzellen der Gefäßwand gebildet wird → tPA = Serinprotease↳ katalysiert die Umwandlung von Plasminogen ...
TPA-25Lokalisation auf dem 8. Chromosom• ist ein Alu-Element → lokalisiert im Intron N° 25 des TPA-Gen◦ gehört zu den Transposons• TPA 25 = dimorph → Auftreten abhängig vom Individuum(homozygot ...
TPA25 Genotypendrei mögliche Genotypen:▪ homozygot positiv → 400 bp Fragmente▪ homozygot negativ → 100 bp Fragmente▪ heterozygot positiv → 400 bp + 100 bp Fragmenteauf einem Allel positiv (400 bp) auf dem ...
VektorenVektoren = Transportvehikel zur Übertragung einer Fremd-Nukleinsäure in eine lebende Empfängerzelle• bei Einbringung von Fremd-DNA in eine Wirtszelle muss man beachten, dass:◦ DNA von Nukleasen ...
Plasmide:= ringförmige, sich autonom replizierende DNA◦ besitzen Startstelle für DNA-Polymerase → ori = origin of replication↳können sich so unabhängig vom Bakterium replizieren◦ Vorkommen in Bakterien ...
• PhagenViren, die Bakterien infizieren◦ Verwendung als Klonierungsvektor (in Gentechnik) → Ersetzen der Phagen-DNA durch Fremd-DNA▪ für die Vermehrung benötigte Bereiche bleiben jedoch erhalten
CosmideHybridmoleküle zwischen Plasmiden und Phagen▪ Eigenschaften von Plasmid: Replikationsstart + Resistenzgen▪ Eigenschaft von Phagen: cos-Stellen mit kohäsiven Enden → siehe λ-Phage◦ autonome ...
Transformation:nsformation:◦ = Übertragung von Fremd-DNA auf prokaryotische Zellen◦ DNA-Replikation nur dann möglich, wenn Replikationsstartpunkt von der Wirtszelle erkannt wird(sonst Abbau der DNA)
Transfektion= Übertragung von Fremd-DNA auf eukaryotische Zellen (ähnlich Transformation)
CaCl2-Methode: (häufig bei Transfektion)Prinzip: Wirtszelle für Aufnahme von DNA fähig machen◦ Behandlung der Wirtszellen mit 0,1 molarer CaCl2-Lösung◦ Calcium-Ionen steigert Aufnahmefähigkeit der Zellen für Fremd-DNA durch Veränderung ...
• Ca3(PO4)2: (häufig bei Transduktion)◦ Mischung von DNA mit Calciumchlorid und phosphathaltiger Pufferlösung → Ausbildung von feinenDNA-Calciumphosphat-Kristallen → bei Kontakt mit Zelloberfläche → Niederschlag◦ Aufnahme der ...
Elektroporation: (häufig bei Transfektion)technisches Verfahren zur Permeabilitätserhöhung von Zellmembranen◦ ermöglicht Einbringung von Fremd-DNA in prokaryotische oder eukaryotische Zellen◦ Erzeugung eines elektrischen Feldes zur stärkeren ...
Elektroporation VErfahrenÄnderung der Konformation der Biomembran bezüglich der Verteilung der Membranbestandteile▪ es kommt zur Abschnürrung von Membranbestandteilen → Bildung von Vesikeln
Elektroporation-folge für zelle▪ erhöhter Ein- und Ausstrom von Flüssigkeiten und Ionen▪ Änderung des intrazellulären bzw. osmotischen Drucks▪ Aufnahme von Biomolekülen (z.B. DNA)
Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)• = Technik zur Unterscheidung von Organismen, die aufgrund ihrer unterschiedlichen DNA-Sequenzunterschiedliche DNA-Schnittmuster aufweisen↳ z.B. zur Bestimmung des Vaterschaftstests• Unterschied ...
bei PCR-RFLP:Amplifizierung eines bestimmten DNA-Abschnittes mittels PCR2. Unterwerfung der gebideten DNA-Fragmente in einem Restriktionsendonuklease-Verdau3. Sichtbarmachung des Schnittmusters mittels Gelelektrophorese ...
Ursachen Folgen RFLPUrsachen der Änderung:1. Basenaustauschmutation in Erkennungssequenz für jeweils eingesetztes Restriktionsenzyms2. Umlagerungen innerhalb der DNA (Inserion, Deletion, Duplikation)• Folgen des Verlustes ...
λ-DNA:stammt von Bakterien-Phage λ:▪ Wirt: E. coli▪ lineare dsDNA▪ besitzen an beiden Enden kurze ssDNA (sind komplementär zueinander)• nach Injektion in Wirt → Rezirkularisierung (zu ringförmiger ...
ϕX14-DNA:◦ Bakteriophage-Phi◦ Wirt: E. coli◦ einzelsträngige, zirkuläre DNA → 3 Konformationen▪ linear (offenkettig)▪ nicked-circular (Einzelstrangbrüche, relaxiert zum Ablesen von Genen)▪ superhelical ...
Enzymatische Spaltung von NukleinsäurenPhosphodiesterasen = Enzyme zum Abbau von Nukleinsäuren↳ Spalten Bindung zwischen den Nukleotiden → Nukleasen (DNasen, Rnasen)• Unterscheidung nach ihrem Angriffspunkt:◦ Endonucleasen: Spaltung ...
Restriktionsendonucleasen Vorkommen /Mechanismusnur bei Bakterien, die sich mit diesem Enzym vor dem Eindringen fremder DNA schützen◦ Mechanismus:▪ Modifizierung der eigenen DNA durch Methylierung mit spezifischen Methylasen → BakterienDNAnicht ...
R-nucleasen eigenschaftenhohe Spaltungsspezifität → Spalten dsDNA an definieren Sequenzen◦ Sequenzen aus mindestens vier Basen besitzen palindromische Struktur (= identische Basensequenz inbeiden Einzelsträngen gelesen ...
Rolle von Mg2+Aktivierung der katalytischen Aktivität der Enzyme↳ Umwandlung in aktive Form durch Bindung an Enzym
Pathoproteinämien· Abweichungen von der physiologischen Serumproteinzusammensetzung · Fraktionen besitzen unterschiedliches elektrophoretisches Verhalten à Elektrophorese kann zur Differenzialdiagnostik herangezogen ...
1. Dysproteinämien· Verschiebung des Verhältnisses der einzelnen Proteinfraktionen · akut entzündliche Prozesse (z.B. Lungenentzündung) à Albumin ↓, α2-Globulin und γ-Globulin ↑ · chronisch entzündliche ...
Defektproteinämien· Mangel oder ein völliges Fehlen einzelner Proteine aufgrund eines genetischen Defektes · Analbuminämien, Caeruloplasminmangel (Morbus Wilson), Transferrinmangel (Eisen-Mangel), Fehlen von Gerinnungsfaktoren ...
Paraproteinämien· Auftreten physiologisch nicht vorkommender Proteine (oder nur in sehr geringen Konzentrationen) · oft verstärktes Auftreten von monoklonalen Immunglobulinen, z.B. bei γ-Plasmozytom (Multiples ...