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Biochemie für Pharmazeuten (Fach) / Harnstoffdiagnostik (Lektion)

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• Detergenzien (hier SDS) Auflösung von Biomembranen◦ Trennung der Nukleinsäure-Histon Bindung◦ Denaturierung der Proteine➢ liegen entfaltet in länglicher, gestreckter Form vor➢ Zerstörung von Lipiden im Zellpellet (im Zellpellet: Proteine, Lipide, Nukleinsäuren)
• TRIS-HCl-Puffer (pH 8,0) DNA wird im sauren protoniert → liegt ungeladen vor➢ die Phenol-Chloroform-Extraktion erfolgt in organischer Phase➢ daher ungeladene DNA schlecht➢ keine Trennung möglich◦ pH-Wert muss > 7,8 sein um Phosphatgruppen zu deprotonieren → DNA wieder negativ geladen◦ TRIS: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol od. Tromethamol (prim. Amin mit Pufferkapazität bei 8,2)
• EDTA dient der Komplexierung bivalente Ionen (v.a. Mg2+)◦ Magnesium = Cofaktor für Ribonuclease / Desoxyribonuklease➢ durch Komplexierung von Mg2+ → Inaktivierung der Nukleasen → Stabilisierung der DNA(da sonst die Nukleasen die DNA bzw. RNA abbauen würden) → Hemmung der DNasen◦ zur Eliminierung von Störfaktoren
• • NaCl Erhöht die Ionenstärke → Abbau der Hydrathülle der Proteine → gelangen so in die organische Phase◦ dient der Isotonisierung➢ Ursache: Zellen sollen nicht unkontrolliert platzen → DNA könnte beschädigt werden
• • bestimmte Ionen (z.B. Mg2+) ◦ Funktion: strukturerhaltende Wirkung für Ribosomen und Zellkern
• • Saccharose (Sorbit, Manit) Funktion als Osmotikum◦ Verhinderung der Schwellung und des Platzens von Organellen (z.B. Mitochondrien, Chloroplasten)◦ Vorteil von Sorbit, Manit: nur geringfügige Verarbeitung im Zellstoffwechsel von Tieren, Pflanzen
• • spezielle Inhibitoren, Stabilisatoren Schutz vor Proteasen → Erhaltung von Struktur und Aktivität vieler Enzyme◦ Inhibitoren:➢ z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Aprotinin, Pepstatin A◦ Stabilisatoren:➢ dienen der Erhaltung des reduzierten Zustands der aktivitätsbestimmenden Sulfhydrylgruppe vonEnzymen➢ z.B. 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DIT), reduziertes Glutathion, Cystein
• Lysepuffer des Praktikums Tris-HCl (pH 8), EDTA, NaCl, SDS
• TPA (tissue Plasminogen Activator) = eine Gensequenz aus 30.000 bp (kann LINE + SINE enthalten)• codiert ein Enzym, das von den Endothelzellen der Gefäßwand gebildet wird → tPA = Serinprotease↳ katalysiert die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin durch limitierte Proteolyse → Hemmung der Blutgerinnung↳ körpereigener Aktivator der Fibrinolyse• TPA-Freisetzung:◦ von Endothelzellen und Leukozyten nach Gefäßdehnung◦ durch eine erhöhte Katecholaminkonzentration
• TPA-25 Lokalisation auf dem 8. Chromosom• ist ein Alu-Element → lokalisiert im Intron N° 25 des TPA-Gen◦ gehört zu den Transposons• TPA 25 = dimorph → Auftreten abhängig vom Individuum(homozygot oder heterozygot)↳ mit Hilfe von PCR kann auf die Anwesenheit dieses Gen- Abschnittes geschlossen werden◦ Bei Anwesenheit von TPA-25 → amplifizierte Fragmentwird 400 bp lang sein◦ Bei Abwesenheit von TPA-25 → amplifizierte Fragmentwird 100 bp lang sein
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• TPA25 Genotypen drei mögliche Genotypen:▪ homozygot positiv → 400 bp Fragmente▪ homozygot negativ → 100 bp Fragmente▪ heterozygot positiv → 400 bp + 100 bp Fragmenteauf einem Allel positiv (400 bp) auf dem anderemnegativ (100 bp) (da 2 Chromosomen → 2 Allele)↳ mit Hilfe von Elektrophorese bestimmbar
• Vektoren Vektoren = Transportvehikel zur Übertragung einer Fremd-Nukleinsäure in eine lebende Empfängerzelle• bei Einbringung von Fremd-DNA in eine Wirtszelle muss man beachten, dass:◦ DNA von Nukleasen abgebaut werden kann◦ DNA bei Teilung einer Zelle ''heraus verdünnt'' werden kann◦ DNA über keinen Replikationsursprung verfügt → keine selbstständige Replikation↳ Einbringung in Zellen mit Replikationsstart erforderlich
• Plasmide: = ringförmige, sich autonom replizierende DNA◦ besitzen Startstelle für DNA-Polymerase → ori = origin of replication↳können sich so unabhängig vom Bakterium replizieren◦ Vorkommen in Bakterien neben weiterer normaler DNA (Plasmid + normale DNA in Bakterien)◦ Vorteil für Bakterien: Enthalten Resistenzgene gegen Antibiotika → Übertragung zw. Bakterien möglich
• • Phagen Viren, die Bakterien infizieren◦ Verwendung als Klonierungsvektor (in Gentechnik) → Ersetzen der Phagen-DNA durch Fremd-DNA▪ für die Vermehrung benötigte Bereiche bleiben jedoch erhalten
• Cosmide Hybridmoleküle zwischen Plasmiden und Phagen▪ Eigenschaften von Plasmid: Replikationsstart + Resistenzgen▪ Eigenschaft von Phagen: cos-Stellen mit kohäsiven Enden → siehe λ-Phage◦ autonome Vermehrung der ringförmigen DNA◦ Klonierung durch in vitro Verpackung der Cosmid-DNA in Phagenköpfen▪ Gelangt in dieser Form durch Infektion in Bakterien◦ Vorteil: höhere Klonierungskapazität als Plasmide
• Transformation: nsformation:◦ = Übertragung von Fremd-DNA auf prokaryotische Zellen◦ DNA-Replikation nur dann möglich, wenn Replikationsstartpunkt von der Wirtszelle erkannt wird(sonst Abbau der DNA)
• Transfektion = Übertragung von Fremd-DNA auf eukaryotische Zellen (ähnlich Transformation)
• CaCl2-Methode: (häufig bei Transfektion) Prinzip: Wirtszelle für Aufnahme von DNA fähig machen◦ Behandlung der Wirtszellen mit 0,1 molarer CaCl2-Lösung◦ Calcium-Ionen steigert Aufnahmefähigkeit der Zellen für Fremd-DNA durch Veränderung derMembrandurchlässigkeit◦ für optimale Aufnahme der Fremd-DNA → Kälte/Wärmebehandlung◦ wenn DNA = Träger eines Resistenzgens als Marker dann:▪ zuerst Überführung in einfaches Nährmedium → gewährleistet Expression des Resistenzgens▪ Überführung in Selektivmedium Prinzip:▪ Membran negativ geladen → Anlagerung von Ca2+ → Membran positiv geladen → Anziehung desnegativen Plasmids in die Nähe der Membran → durch Erhitzen auf 42°C Zerstörung der Membran→ Plasmid kann in die Zelle rein diffundieren → Voraussetzung: genügend vorhandenes Plasmid
• • Ca3(PO4)2: (häufig bei Transduktion) ◦ Mischung von DNA mit Calciumchlorid und phosphathaltiger Pufferlösung → Ausbildung von feinenDNA-Calciumphosphat-Kristallen → bei Kontakt mit Zelloberfläche → Niederschlag◦ Aufnahme der DNA in die Zelle durch Endozytose◦ häufig in Kombination mit CaCl2-Methode
• Elektroporation: (häufig bei Transfektion) technisches Verfahren zur Permeabilitätserhöhung von Zellmembranen◦ ermöglicht Einbringung von Fremd-DNA in prokaryotische oder eukaryotische Zellen◦ Erzeugung eines elektrischen Feldes zur stärkeren Durchlässigkeit der Membran notwendig↳ Auflockerung der Membran → Plasmid gelangt leichter in die Zelle◦ Gerät: Bioporator▪ = schnell entladender Kondensator▪ Einbringung der Zellsuspension in zentralen Hohlraum▪ Befinden von zwei Aluminiumelektroden am Außenrand des Hohlraums
• Elektroporation VErfahren Änderung der Konformation der Biomembran bezüglich der Verteilung der Membranbestandteile▪ es kommt zur Abschnürrung von Membranbestandteilen → Bildung von Vesikeln
• Elektroporation-folge für zelle ▪ erhöhter Ein- und Ausstrom von Flüssigkeiten und Ionen▪ Änderung des intrazellulären bzw. osmotischen Drucks▪ Aufnahme von Biomolekülen (z.B. DNA)
• Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) • = Technik zur Unterscheidung von Organismen, die aufgrund ihrer unterschiedlichen DNA-Sequenzunterschiedliche DNA-Schnittmuster aufweisen↳ z.B. zur Bestimmung des Vaterschaftstests• Unterschied zweier Organismen in ihrer DNA-Sequenz → Unterschied im Abstand derRestriktionsendonuklease-Schnittstellen → Entstehung von Fragmente unterschiedlicher Längen• Verwendung der Übereinstimmung bzw. des Unterschieds der gelelektrophoretisch sichtbar gemachtenSchnittmuster zur Differenzierung von Spezies↳ durch Betrachtung der Fragmente → Feststellung von Verwandtschaften↳ zum Testen auf Krankheiten schon vor der Geburt → Mutationen ändern die Fragmentlängen
• bei PCR-RFLP: Amplifizierung eines bestimmten DNA-Abschnittes mittels PCR2. Unterwerfung der gebideten DNA-Fragmente in einem Restriktionsendonuklease-Verdau3. Sichtbarmachung des Schnittmusters mittels Gelelektrophorese
• Ursachen Folgen RFLP Ursachen der Änderung:1. Basenaustauschmutation in Erkennungssequenz für jeweils eingesetztes Restriktionsenzyms2. Umlagerungen innerhalb der DNA (Inserion, Deletion, Duplikation)• Folgen des Verlustes oder Auftretens einer neuen Erkennungssequenz bei Spaltung genomischer DNA:◦ Verlust bzw. Auftreten eines neuen DNA-Fragments◦ Verlängerung oder Verkürzung anderer Fragmente
• λ-DNA: stammt von Bakterien-Phage λ:▪ Wirt: E. coli▪ lineare dsDNA▪ besitzen an beiden Enden kurze ssDNA (sind komplementär zueinander)• nach Injektion in Wirt → Rezirkularisierung (zu ringförmiger DNA)• Ende = kohäsive Enden, homologe Bindeenden, klebrige Enden (sticky ends)
• humane DNA ◦ vorliegen von dsDNA
• ϕX14-DNA: ◦ Bakteriophage-Phi◦ Wirt: E. coli◦ einzelsträngige, zirkuläre DNA → 3 Konformationen▪ linear (offenkettig)▪ nicked-circular (Einzelstrangbrüche, relaxiert zum Ablesen von Genen)▪ superhelical (nativ, supergeknäult)↳alle haben die gleiche Masse → im Agarosegel durch sterische Unterschiede Auftrennung möglich
• Enzymatische Spaltung von Nukleinsäuren Phosphodiesterasen = Enzyme zum Abbau von Nukleinsäuren↳ Spalten Bindung zwischen den Nukleotiden → Nukleasen (DNasen, Rnasen)• Unterscheidung nach ihrem Angriffspunkt:◦ Endonucleasen: Spaltung von Nukleinsäure an jeder beliebigen Stelle◦ Exonucleasen: Abbau von Nukleinsäure von einem Ende des Moleküls▪ unterschiedliche Spezifität je nach Nucleotidspaltung von 5' → 3' oder 3' → 5'
• Restriktionsendonucleasen Vorkommen /Mechanismus nur bei Bakterien, die sich mit diesem Enzym vor dem Eindringen fremder DNA schützen◦ Mechanismus:▪ Modifizierung der eigenen DNA durch Methylierung mit spezifischen Methylasen → BakterienDNAnicht mehr angreifbar → Phagenabwehr▪ fremde DNA wird nicht methyliert → Abbau durch Restriktionsendonukleasen
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• R-nucleasen eigenschaften hohe Spaltungsspezifität → Spalten dsDNA an definieren Sequenzen◦ Sequenzen aus mindestens vier Basen besitzen palindromische Struktur (= identische Basensequenz inbeiden Einzelsträngen gelesen vom 5'-Ende → daher Spaltung von dsDNA wahrscheinlicher)
• Rolle von Mg2+ Aktivierung der katalytischen Aktivität der Enzyme↳ Umwandlung in aktive Form durch Bindung an Enzym
• Pathoproteinämien ·  Abweichungen von der physiologischen Serumproteinzusammensetzung · Fraktionen besitzen unterschiedliches elektrophoretisches Verhalten à Elektrophorese kann zur Differenzialdiagnostik herangezogen werden
• 1. Dysproteinämien ·  Verschiebung des Verhältnisses der einzelnen Proteinfraktionen ·  akut entzündliche Prozesse (z.B. Lungenentzündung) à Albumin ↓, α2-Globulin und γ-Globulin ↑ ·  chronisch entzündliche Prozesse (z.B. Leberzirrhose, Leberparenchymschäden, Hepatitis) à Albumin ↓, γ-Globulin ↑ (Albumin nimmt erst im späten Stadium der Leberschädigung stark ab, dann à Aszites) ·  Plasmozytom (Multiples Myelom) (monoklonal verlaufende neoplastische Proliferation von Plasmazellen und Bildung von Leichtketten à Bence-Jones-Proteinurie; Plasmazellen sind immunologisch unwirksam) à γ-Globulin ↑, Infektabwehr ist herabgesetzt ·  Nephrotisches Syndrom (Entzündung des Nierenparenchyms) à α2-Globulin ↑, Albumin ↓ durch Proteinurie (Grund: Basalmembran kaputt, dadurch Siebeffekt und Abstoßungseffekt weg à Albumin wird als kleines Molekül ausfiltriert)
• Defektproteinämien · Mangel oder ein völliges Fehlen einzelner Proteine aufgrund eines genetischen Defektes ·  Analbuminämien, Caeruloplasminmangel (Morbus Wilson), Transferrinmangel (Eisen-Mangel), Fehlen von Gerinnungsfaktoren (Hämophilie à Fun Fact: Frauen erkranken nicht, sondern geben es nur weiter)
• Paraproteinämien · Auftreten physiologisch nicht vorkommender Proteine (oder nur in sehr geringen Konzentrationen) ·  oft verstärktes Auftreten von monoklonalen Immunglobulinen, z.B. bei γ-Plasmozytom (Multiples Myelom; monoklonale Plasmaproteine werden produziert, aber nicht ausgereift à viel Müll)

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