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Bioanalytik (Fach) / Chromatographie (Lektion)

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• Wann, wie und von wem wurde die erste Chromatographie durchgeführt? - 1850 durch Runge - Papierchromatographie - "Keine Willkür, wie sie der Pinsel übt."
• Wann, wie und von wem wurde die erste "echte" Chromatographie durchgeführt? - 1907 von Michail Semjonowitsch Tswett - Auftrennung eines Chlorophyll-Extraktes in einer mit Inulin gefüllten Säule - Namensgebung durch aufgetrennte, farbige Banden
• Wann, für wen und wofür gab es den ersten Nobelpreis für Chromatographie? - 1938 für Richard Johann Kuhn - Für Publikation über Trennung von alpha- und beta-Carotin in 1931
• Was ist Chomratographie und was sind die Voraussetzungen? - Auftrennung von Stoffgemischen über die unterschiedliche Verteilung in 2 nicht mischbaren Phasen - Feststoffe müssen löslich und Flüssigkeiten unzersetzt verdampfbar sein
• Was ist das allgemeine Wirkungsprinzip der Chromatographie? - Analyt wird von der mobilen Phase absorbiert und der stationären Phase adsorbiert, dies ist reversibel und dynamisch. probe wandert langsamer als die mobile Phase. Geschwindigkeit ist von den Gleichgewichtskonstanten der Absorption und Adsorption abhängig. - Der Verteilungskoeffizient K = (A stationär/A mobil) beschreibt das Verhältnis der Konzentrationen im Zustand des thermodynamischen Gleichgewichts. Für eine Trennung sind verschiedene K-Werte nötig. -
• Wie können unterschiedliche Chromatographien eigneteilt werden? - Aggregatzustand von mobiler und stationärer Phase - nach Anordnung der stationären Phase (planar, Säule) - Nach Art der Trennung (Affinität, Verteilungschromatographie, Ausschlusschromatographie)
• Was beschreibt der Retentionsfaktor Rf? Was ist die (Netto-) Retentionszeit tR? - Ist der Quotient aus Laufstrecke der Substanz zur Laufstrecke der moblien Phase - Zeit, die eine Substanz um vollständigen Durchlauf des chromatographischen Systems benötigt - Die Totzeit tm gibt an, wielange die mobile Phase zum vollständigen Durchlauf des Systems benötigt. - Die Nettoretentionszeit t'R beschreibt die Zeit, die eine Substanz in der stationären Phase verbringt
• Wozu dienen die Peak-Basisbreite und die Peakfläche? - Die Zeit t0 beschreibt den Trägergaspeak. t1 und t2 sind die Peaks von Proben, d.h. die Retentionszeiten. - Die Peak-Basisbreite ist die Strecke, die von den Tangenten der Wendepunkte der Gaußkurve auf der Nulllinie begrenzt wird. Eine wird innerhalb, eine außerhalb des Peaks gezeichnet, um die Linie des Schreibers zu berücksichtigen. - Die Peak-Fläche gibt Aufschluss über die Konzentration einer Substanz
• Was ist der Retentionsfaktor k'? - Ist eine dimensionslose Größe, die den Vergleich verschiedener chromatographischer Systeme ermöglicht. - Er gibt an, wieviel länger sich eine Probensubstanz auf der Trennstecke aufhält im Vergleich zur mobilen Phase. - Ist das Produkt des Verteilungskoeffizienten K und des Phasenvolumenverhältnisses Vs/Vm. - k' = K * Vs/Vm
• Was bschreibt die Selektivität alpha? - relativer trennfaktor, Maß für die Trennbarkeit zweier Substanzen - wird aus dem Quotienten der Retentionsfaktoren berechnet. - bei alpha = 1 ist keineTrennung möglich. - je größer alpha, desto besser die Trennung aber desto mehr Zeit braucht die Chromatographie, d.h. wird alpha = 1,5 angestrebt
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• Was ist die Auflösung R? - berücksichtigt relative Lage der Peaks und ihre Basisbreiten - die Differenz der Retentionszeiten muss im Verhältnis zu den Basisbreiten groß sein, um eine gute Auflösung zu erreichen. - für qualitative Trennungen sollte R = 1 sein, für quantitative Trennungen 1,2 bis 1,5.
• Beschreiben Sie das Modell der theoretischen Trennstufen. - stammt aus Destillationsprozessen und unterteilt die stationäre Phase in einzelne Abschnitte. - auf jeder theoretischen Trennstufe erfolgt prinzipiell einmal eine reversible und unendlich schnelle Gleichgewichtseinstellung zwischen mobiler und stationärer Phase. - Die Leistungsfhigkeit eines Systems hngt von einer möglichst hohen Anzahl an theoretischen Trennstufen ab. - Kann durch N = 16 * (tR/w)² berechnet werden. - aufgrund von Diffusion und Strömung ist die Gleichgewichtseinstellung endlich und unvollständig, weshalb es zur Bandenverbreiterung kommt. - deshalb berechnet man die effektive Zahl der Trennstufen n = N (k'/k'+1)²
• Was kann das Modell der theoretischen Trennstufen leisten? Wie kann das Modell praktisch helfen? 1. relative Wanderungsgeschwindigkeit einer Susbtanz beschreiben 2. die Gaußsche Form der Peaks erklären und die Effizienz einer Säule beschreiben. 3. die Effizienz einer Säule als Bodenzahl abschätzen. 1. Auswahl der mobilen und stationären Phase 2. Bestimmung von optimaler Säulenlänge und -effizienz. 3. Kontrolle der Säuleneffizienz
• Was kann das Modell der theoretischen Trennstufen nicht leisten? - keine garantierte Säuleneffizienz, da der Gleichgewichtszustand niemals realisiert werden kann - Bandenverbreiterung ist abhängig von linearer Fließgeschwindigkeit, Diffusionskoeffizienten und dicke des Flüssigkeitsfilms auf der stationären Phase sowie Teilchengröße der Packung
• Welche Prozesse tragen zur Bandenverbreiterung bei? 1. Streudiffusion, abhängig von Art des Füllmaterials, Korngröße und Packungsgüte 2. axiale Diffusion, umgekehrt Proportional zur Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase. 3. Massentransfer in beiden Phasen, proportional zur Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase.
• Erklären Sie die Van-Deemter-Theorie - beschreibt den chromatographischen Trennprozess als dynamischen Prozess unter Berücksichtigung von Diffusion und Massentransfer. - Verknüpfung der Trennstufenhöhe mit der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase. - H = A + B/u + C * u - Der Wirkungsgrad einer Säule hängt von der Strömungsgeschwindigkeit ab. Bei uopt ist Hmin am geringsten und die Auflösung am besten. - uopt ist abhängig von Innendurchmesser der Säule bzw. Partikelgröße der Packung, Art der mobilen Phase und Probenkomponenten
• Welche Komponenten enthält die Van-Deemter-Gleichung? A = Streudiffusion, abhängig von Füllmaterial, Korngröße und Packungsgüte B = axiale Diffusion, abhängig davon, wielange sich Probenmoleküle in der mobilen Phase befinden. C = Massenübergangsterm. Beschreibt die Geschwindigkeit, mit der sich Probenmoleküle zw. beiden Phasen verteilen. Bei hoher Strömungsgeschwindigkeit haben die Moleküle dazu wenig Zeit für die Einstellung des Verteilungsgleichgewichtes und es kommt zu breiteren Peaks.
• Wie kann eine chromatographische Methode optimiert werden? - geringe Korngrößen bzw. Filmdicken stationärer Phasen - homogene Packung der stationären Phase durch engverteilte Materialien - kleine Säulendurchmesser - große Diffusionskoeffizienten in der stationären Phase und kleine in der mobilen Phase
• Welche Eigenschaften können zur chromatographischen Trennung genutzt werden? - Affinität - Größe - Ladung - Verteilung - Adsorption
• Was ist Adsorption? - Anlagerung eines Stoffes an einen anderen ohne chemische Bindung - basiert auf H-Brücken und Ionenbeziehungen - ist häufig abhängig von Temperatur, Elution über Temperaturgradient möglich.
• Wie wird eine Adsorptionschromatographie praktisch umgesetzt? - oft feste Adsorbenzien wie Kieselgel, Aluminiumoxid, Dextrangele - Mit Dünnschicht oder Säule, Gas oder Flüssigkeit möglich. - reine Adsorptionschromatographien sind selten
• Was ist die Verteilungschromatographie? - basiert auf unterschiedlicher Löslichkeit der Bestandteile des Analyten in einer Flüssigkeit - die stationäre Phase besteht entweder aus einem Flüssigkeitsfilm an der Säulenwand oder einer Flüssigkeit, die an einem festen Träger gebunden ist. - die mobile Phase ist ein Gas oder eine nicht-mischbare Flüssigkeit
• Welche stationären Phasen werden bei der Verteilungschromatographie verwendet? - in DC: dünne Schicht eines feinkörnigen Materials wie z.B. Kieselgel auf Trägerplatte. - Säule: Kieselgel in gleichmäßiger Packung in einer Säule aus Metall oder Glas. - freie endständige Hydroxygruppen am Kieselgel machen dieses zu einem polaren Adsorbens - Reverse Phase: unpolare Säule und polares Lösungsmittel
• Nennen sie Aspekte der Verwendung von Lösungsmitteln in der Verteilungschromatographie - die mobile Phase in der LC ist gleichzeitig auch das Elutionsmittel - Elution ist das Herauslösen von adsorbierten Stoffen. - die meisten org. Lösungsmittel sind anhand ihrer Elutionskraft in der elutropen Reihe sortiert. - der Trenneffekt der HPLC beruht auf der unterschiedlichen Polarität der beiden Phasen - unpolare LM: Hexan, Heptan - polare LM: Wasser, Methanol - Die Elutionskraft der LM für Umkehrphasen beruht auf dem Verhältnis von Wasser und org. LM. Immer Gemische!
• Was ist die elutrophe Reihe? - Auflistung org. Lösungsmittel nach Elutionskraft - basiert auf empirischen Daten - Über das Mischungsverhältnis kann man die Polarität steuern
• Wie erfolgt die Elution in einer Flüssigchromatographie? - isokratisch = gleichbleibende Zusammensetzung der mobilen Phase. Früh eluierte Komponenten erscheinen stark gedrängt, für spätere ergeben sich breite Peaks -> allg. Elutionsproblem. - das allg. Elutionsproblem kann durch Verwendung eines Lösungsmittelgradienten gelöst werden

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