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Biochemie ELW (Fach) / Laborpraktikum Biochemie (Lektion)

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• Versuchsziel: Polymerasekettenreaktion (PCR) Vervielfältigung und Identifizierung spezifischer DNA-Sequenzen (Vermehrung und Differenzierung der Plasmide)
• Versuchsprinzip PCR PCR ermöglicht, spezifische DNA-Sequenzen enzymatisch milionenfach zu "kopieren" 1. Denaturierung mittels hoher Temperaturen H-Brücken zwischen Basen werden gelöst --> Auftrennung in Einzelstränge 2. Annealing = Anlagerung und Hybridisierung der Primer bei spezifischer Temperatur Sense-Primer und Anti-Sense-Primer Annealing Tmep. abhängig von GC/AT-Verhältnis und Sequenz + Länge des Primers 3. Elongation = Synthese der komplementären DNA-Stränge durch TAG-Polymerase Einbau freier Nukleotide TAQ-Polymerase aus thermophilen Bakterien --> hohes Temp-optimum bei 72°C
• Was enthalten die Proben für die PCR? DNA TAQ-Puffer --> optimale Umgebung für TAQ-Polymerase MgCl2 --> Mg2+-Ionen werden von TAQ-Polymerase zur Komplexbildung benötigt dNTPs (Desoxyribonukleosidtriphosphate) --> freie Nukleotide = Bausteine für DNA Primer (Sense + Anti-Sense) --> Einzelsträngige Oligonukleotide, markieren Startpunkt und liefern freies 3'OH-Ende für Polymerase TAQ-Polymerase H2O
• Versuchsziel: Agarose-Gelelektrophorese (PCR) Auftrennung und Identifizierung der mittels PCR amplifizierten (= vermehrten) DNA-Abschnitte anhand ihrer Größe
• Versuchsprinzip: Agarose-Gelelektrophorese (PCR) Nukleinsäuren bei neutralem pH polyanionisch geladen = negativ geladen --> wandern im elektrischen Feld auf positive Elektrode zu Trägermaterial = Agarose = Zuckerpolymer (Galaktose + Anhydrogalaktose) wird durch Aufkochen mit TBE-Puffer in Gelform gebracht --> Netzwerk DNA-Fragmente wandern durch das Netzwerk und werden nach Größe aufgetrennt elektrophoretische Mobilität aller Nukleinsäuren in freier Lösung gleich groß --> Wandergeschwindigkeit ausschließlich durch Größe bestimmt Vergleich der Laufstrecke mit DNA-Fragmenten bekannter Größe zur Identifizierung Referenzmarker werden mit auf das Gel aufgetragen
• Wie wird das Agarosegel für die Gelelektrophorese hergestellt? Inhaltsstoffe und ihr Sinn Agarose = Zuckerpolymer aus Galaktose und Anhydrogalaktose, dient als Trägermaterial TBE- Puffer (Tris-Borat-EDTA) = durch Aufkochen mit Agarose kommt es zur Gelbildung durch Quervernetzung von H-Brücken Tris-Borat = Puffersubstanz EDTA = Komplexierung zweiwertiger Metallionen PEQ-Green = interkaliert in die DNA und leuchtet unter UV-Licht grün kommt nach dem Abkühlen dazu lagert sich zwischen den Basen an dient der Sichtbarmachung der DNA im Gel
• Wie werden die PCR-Proben für die Gelelktrophorese vorbereitet? Inhaltsstoffe und ihr Sinn 6% Loading Dye = Lade-/Probenpuffer  Brommethylblau --> Anfärben der Proben um Laufmittelfront sichtbar zu machen Glycerol + Xylencyanol --> Verdichtung/Beschwerung der Proben, damit sie besser in die Taschen absinken
• Versuchsziel: Transformation des Plasmids in eine Bakterienzelle Aufnahme und Vervielfältigung derFremd-DNA durch ein Bakterium Transformation bei Prokaryoten vs.Transfektion bei Eukaryoten
• Was ist Transformation? Welche Theorien gibt es zu dem dahinter steckenden Mechanismus? Vorgang, bei dem durch einen noch ungeklärten Menchanismus Fremd-DNA in Bakterien (Prokaryoten) aufgenommen wird unter natürlichen Bedingungen nur sehr selten 2 Theorien Fremd-DNA wird während Inkubation aus Eis an der Membran angelagert und durch den folgenden Hitzeschock aufgenommen Fremd-DNA gelangt bei der Inkubation auf Eis in die Zelle, dessen Membran durch den anschließenden Hitzeschock wieder verschlossen wird
• Was ist unter kompetenten Zellen/Bakterien zu verstehen? Bakterien, die zum Beispiel mit Rubidiumchlorid behandelt wurden, um ihre Zellwände porös zu machen --> Vorbereitung für die Aufnahme von Fremd-DNA 
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• Wie können transformierte Bakterien von nicht-transformierten unterschieden werden? Fremd-DNA, die für die Transformation verwendet wird ist mit Resistenzgen ausgestattet --> Anzucht/Vermehrung der Bakterien auf einem Nährmedium mit Antibiotika und anschließende Kultivierung der gewachsenen Bakterien
• Unterschied zwischen der DNA-Replikation bei der PCR und bei der Transformation bei Transformation wird der gesamte Plasmidring repliziert, bei PCR nur spezifische Fragmente
• Durchführung: Transformation 1. Ankagerung und Aufnahme der Plasmide in die Bakterienzellen kompetente Bakterien (E.coli) werden auf Eis mit Plasmid-DNA gemischt und inkubiert --> Anlagerung der Plasmid-DNA an die Membran Einminütiger Hitzeschock bei 42°C im Wasserbad --> Aufnahme der Plasmide Abkühlung auf Eis 2. Ausprägung der Resistenz und Selektion der transformierten Bakterien Ausprägung der Resistenzen auf einem Vollmedium ohne Antibiotikum (LB-Medium) Bakteriensuspension auf LB-Platten mit Antibiotikum (Ampicillin, Kanamycin) ausplattieren und inkubieren --> es wachsen nur die resistenten, also die transormierten Bakterien
• Versuchsziel: Analytische Plasmidpräparation Isolierung der mittels Transformation in den Bakterienzellen vervielfältigten Plasmid-DNA 
• Versuchsprinzip: Analytische Plasmidpräparation (Mini-Präparation) Alkalische Lyse der Bakterienzellwand und anschließende Neutralisation um (bei Transformation) aufgenommene Plasmid-DNA freizusetzen bzw. zu isolieren Plasmid-DNA bleibt in Lösung, während Proteine und chromosomale DNA ausfallen Plasmid-DNA bindet unter leicht sauren Bedingungen an Silikate Alkalischer Zelllysepuffer --> Zellwand wird porös Neutralisationpuffer --> stoppt Zelllyse und säuert Probe an
• Materialien/Stoffe, die für die Plasmidpräparation benötigt werden Resuspensionspuffer --> Resuspension des durch zentrifugation entstandenen Bakterienpellets  enthält Ribonukleasen (katalysieren Spaltung von Phosphodiesterbindungen in RNA) und sorgt dafür, das keine RNA im Probenansatz zu Verunreinigungen führt. RNA würde sonst auch an Silikat-Säule binden. Alkalischer Zelllysepuffer macht Zellwand porös --> Austritt der Plasmid-DNA darf nicht zu lange einwirken weil Zellwand sonst zu porös wird und chromosomale DNA mit austreten könnte Neutralisationspuffer stoppt die Zelllyse und säuert Probe an --> erleichtert Bindung der Plasmid-DNA an Silikat-Säule Zentrifuge Durch Znetrifugation setzen sich Bakterientrümmer und chromosomale DNA ab, während Plasmid-DNA in Lösung bleibt --> Pellet kann verworfen werden, Überstand wird weiterverwendet Silikat-Säule Überstand mit Plasmid-DNA wird auf Silikat-Säule pipettiert --> Plasmid-DNA lagert sich an Säule an Waschpuffer Waschritt bei dem die an die Säule gebundene DNA mittels Puffer und Zentrifugation gewaschen wird (2 mal) Elutionspuffer um DNA von der Silikatsäule zu eluieren wird Elutionspuffer auf die Säule pipettiert und zentrifugiert durch erhöhten pH und Zentrifugation wird Bindung der DNA an die Säule gelöst --> Elution in ein Eppi
• Versuchsdurchführung: Plasmidpräparation 1. Zelllyse und Neutralisation Resuspension und Beseitigung von RNA aus der Probe mittels Resuspensionspuffer Zelllyse mittel alkalischem Zelllysepuffer --> Zellwand porös --> Austritt der Plasmid-DNA Stopp der Zelllyse und Ansäuerung der Probe durch Neutralisationspuffer --> Bindung der Plasmid-DNA an Silikatsäule nur unter sauren Bedingungen Zentrifugation --> Bakterientrümmer + chromsomale DNA setzen sich ab, Plasmid-DNA bleibt in Lösung --> Überstand behalten! 2. Isolierung der Plasmid-DNA Überstand wird auf Silikatsäule pipettiert und anschließend zentrifugiert Waschschritt mittels Waschpuffer und Zentrifugation der Säule Elution der Plasmid-DNA von der Silikat-Säule in ein Eppi mittel Elutionspuffer und Zentrifugation --> erhöhter pH + Zentrifugation sorgt dafür, dass Bindung an Silikat-Säule gelöst wird
• Versuchsziel: Photometrische Konzentrationsbestimmung Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der in der Plasmidpräparation aus den Bakterien isolierten Plasmid-DNA* * diese wurde zuvor bei der Transformation von den Bakterien aufgenommen und vermehrt
• Versuchsprinzip: Photometrische Konzentrationsbestimmung 1. Messung der Absorption der Plasmid-DNA-Probe bei 260 nm gegen einen Blindwert 260 nm = Absorptionsmaximum Nukleinsäuren 2. Zweite Messung bei 280 nm um Verunreinigungen durch Proteine festzustellen (z.B. aromatische AS) Abschätzung des Reinheitsgrades der DNA-Lösung indem man die zwei Absorptionswerte ins Verhältnis setzt Werte 1,8-2 sind als "gut" einzustufen 3. Zusätzliche Absorptionsmessung bei 320 nm um andere Verunreinigungen auszuschließen (Salze, Zucker, Phenole)
• Warum muss die DNA-Probe für die Absorptionsmessung bei der photometrischen Konzentrationsbestimmung mit Wasser verdünnt werden? Weil das Lambert-Beersche-Gesetz nur für verdünnte Lösungen gilt A = E x C x d
• Versuchsziel: Restriktionsendonukleasen Identifizierung der in der analytischen Plasmidpräparation aus den transformierten Bakterien gewonnen Plasmid-DNA durch Schneiden (Verdauen) mittels Restriktionsendonukleasen und anschließender Auftrennung im Agarosegel Restriktionsendonukleasen = Enzyme, die bestimmte palendromische Basensequenzen innerhalb der DNA erkennen und schneiden
• Was sind Restriktionsendonukleasen Enzyme, die bestimmte palendromische Basensequenzen innerhalb der DNA erkennen und spezifisch schneiden kommen auch natürlich in Prokaryoten vor, wo die eigene DNA durch Methylierung vor ihnen geschützt ist --> Schutz vor Fremd-DNA durch schneiden an versch. spezifischen Stellen, entstehen unterschieldlich viele und unterschieldich große DNA-Fragmente aus dem Plasmid-Ring anhand der Anzahl und Größe der DNA-Fragmente kann die Plasmid-DNA identifiziert werden
• Warum muss Plasmid-DNA vor der Gelelektrophorese geschnitten werden (mit Restriktionsendonukleasen)? weil intakte Plasmide in unterschiedlicher Konformation vorliegen linear, offenkettig, supercoil-form verhalten sich im elektrischen Feld unterschiedlich --> Bildung mehrerer Banden, die nicht mit dem linearen Größenstandard vergleichbar sind --> Identifizierung schwierig durch das Schneiden entstehen lineare Fragmente
• Welche drei Restriketionsendonukleasen wurden im Praktikum verwendet? Bam HI (Einzelverdau) Hind III + Xho I (Doppelverdau)
• Wie können die durch Restriktionsverdau entstandenen DNA-Fragmente zur Identifizierung der Plasmid-DNA dienen? Restriktionsendunukleasen schneiden an spezifischen Stellen in der Plasmid-DNA (diese sind bekannt) auf einer Plasmidkarte kann nachvollzogen werden, wie viele DNA-Fragmente entstehen müssten und welche Größe diese haben Die DNA-Fragmente werden mittels Gelelektrophorese nach ihrer größe aufgetrennt --> sichtbar wie viele und wie große Fragmente entstanden sind --> Vergleich mit Plasmidkarte
• Was sind palindromische DNA-Sequenzen? DNA-Sequenz aus 4-8 Basenpaaren, deren Einzelstränge jeweils gegenüber dem Komplementärstrang eine horizontal spiegelverkehrte Basenfolge aufweisen (Zeichenkette, die sich von vorne und hinten gelesen gleicht)
• Was ist ein Plasmid Ringförmige extrachromosomale DNA
• Wie muss die Sequenz für ein Restriktionsenzym aussehen? Palindrom
• Welche chemischen Bindungen spalten Restriktionsendonukleasen? Phosphodiesterbindungen (der GC-Paare)
• Welche Informationen können einer Plasmidkarte entnommen werden? Resistenzgene bzw. Selektionsgene Restriktionsschnittstellen (multiple Klonierungsstellen) Anzahl der Basenpaare (Größe) Replikationsursprung Ori (Ort auf DNA-Molekül, an dem die Replikation der DNA beginnt) Proteingene (NCAM, eGFP) Promotorsequnenzen (SV40/PCMV)
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• Materialien die für den Restriktionsverdau benötigt werden. Stoffe und ihre Funktion dest. Wasser --> Medium Spezifischer Puffer (Cutsmart-Puffer) --> sorgt für optimale Reaktionsbedingungen für die Restriktionsendonukleasen unterschiedliche Aktivität der Endonukleasen in unterschiedlichen Puffern (hier: Bam HI und Xho I 100%, Hind II 50%) Restriktionsendonukleasen (Bam HI, Hind III, Xho I) --> schneiden spezifisch doppelsträngige DNA --> DNA-Fragmente bestimmter Größe entstehen Plasmid --> wird geschnitten
• Inhaltsstoffe und Sinn eines Loading Dye Lösung mit gepufferten pH-Wert, der vor einer Gelelektrophorese den Proben zugesetzt wird Brommethylblau --> Anfärbung zur Markierung der Laufmittelfront Xylencyanol/Glycin --> Verdichtung der DNA-Lösung, damit diese in die Taschen absinkt Stabilisierung des pH-Werts der Probe
• Durchführung: Restriktionsverdau 1. Restriktionsverdau durch Endonukleasen Ansetzen der Verdauungsansätze mit dest. Wasser, spezifischem Puffer (Cutsmart), Endonukleasen (Bam HI, Hind III, Xho I) und Plasmide Zentrifugation und Inkubation beim 37 °C für 1-2 h 2. Auftrennung und Charakterisierung der DNA-Fragmente mittels Agarose-Gelelektrophorese Verdauungsansätze mit Laoding-Dye versehen und auf das Gel auftragen Marker mit auftragen intaktes Plasmid mit auftragen
• Was ist bei Zellkulturen unter Subkultivierung zu verstehen und wozu dient sie? Alle Kulturschritte, die nach der Entnahme der Zellen aus dem Zielgewebe und ihrer Immortalisierung  sowie der ersten Kultivierung geschehen.  Kultivierung nach der Primärkultur
• Wie wird eine dauerhaft kultivierbare Zelllinie erzeugt? Immortalisierung = Aufhebung der Begrenzung der Anzahl von Zeillteilungen in einer Zelle Bsp.: Cos-7 Zellen werden mit Hilfe des SV40 Virus immortalisiert. stabil mit einer Mutante des Virus transformiert --> produzieren Tumor-Antigen --> unbegrenzte Teilung der Zellen
• Eigenschaften von Cos-7-Zellen Fibroblasten-Zelllinie aus Nierengewebe der grünen Meerkatze adhärent = benötigen Oberfläche wachsen stabil mit einer Mutante des SV40-Virus transformiert und produzieren daher das Tumor-Antigen
• Arten von Zellkulturen Organkulturen: der in vivo bestehende charakteristische Aufbau des Gewebes bleibt zumindest teilweise erhalten. Primärexplantate: Gewebestückchen werden in Kultur genommen, um an einer Grundlage zu adhärieren, das Auswandern oder Auswachsen von Zellen kann dabei beochachtet werden. Zellkultur (primäre Zellen): Gewebe oder die von einem Explantat auswandernden Zellen werden mechanisch oder enzymatisch zu einer Zellsuspension dispergiert und dann entweder als adhärente Einzelschicht (Monolayer) auf einer festen Grundlage in Kulturmedium oder als Suspensionskultur kultiviert (meist Primärzellkultur). Zelllinie: Dauerhaft etablierte Zellkultur, die sich unter definierten Bedingungen unbegrenzt vermehrt. Es werden i. d. R. immortalisierte Zelllinien (z. B. Krebszelllinien) verwendet.
• Was ist unter "Konfluenz" zu verstehen? die größtenteils lückenlose Bedeckung der Oberfläche eines Kulturgefäßes mit adhärenten (anheftenden) Zellen. Zellen befinden sich bei der Konfluenz in sehr engem Zell-Zell-Kontakt, sodass keine Oberfläche als Substrat frei vorhanden ist. Durch die Kontakthemmung hören die meisten Zellen auf, sich zu teilen.
• Versuchsprinzip: Subkultivierung von Cos-7-Zellen Ablösen der Zellen von ihrer ursprünglichen Oberfläche (Kulturflasche) durch enzymatische Dissoziation Aufschließung der Zellkontakte und damit Lösung von der Kontaktoberfläche durch Trypsin (spaltet u. a. Zelladhäsionsmoleküle) Inaktivierung von Trypsin mittels Serum oder Nährmedium nicht meachanisch, damit Zellen nicht beschädigt werden
• Wie wurden die Cos-7-Zellen im Praktikum kultiviert? Stoffe/Medien und ihr Sinn in DMEM-H-Medium mit Zusatz von FCS und Penicillin + Streptomycin (Medienwechsel alle 2-3 Tage) DMEM-H = Dulbecco's Modified Eagle Medium - High Glucose Glukose = Nährstoff Phenolrot = pH-Indikator (rot --> gelb bei saurem pH) stoppt Trypsinierung FCS = fetales Kälberserum liefert Proteine und Wachstumsfaktoren Penicillin/Streptomycin = Antibiotika verhindern bakterielle Kontamination der Zellen
• Durchführung: Subkultivierung Cos-7-Zellen 1. Enzymatische Dissoziation Absaugen des verbrauchten Mediums und Waschen mit HBSS (Hanks-Balanced Salt Solution) --> Entfernung zweiwertiger Kationen, die die Zelladhäsion fördern und überschüssiger Proteine zur Erleichterung der Trypsinierung Zugabe von Trypsin-EDTA --> enzymatische Lösung der Zellen von Kulturgefäß (EDTA kompexiert für die Bindung benötigte Ca-/Mg-Kationen und Trypsin u. a. Zelladhäsionsmoleküle) 2. Stoppen der Trypsinierung Waschen mit DMEM-H um Trypsinierungzu stoppen und Zellen vom Boden abzuspülen Überführung der entstandenen Zellsuspension in Röhrchen und anschließende Zentrifugation 3. Subkultivierung sedimentierte Zellen mit frischem Medium (DMEM-H) resuspendieren und in unterschiedlichen Verdünnungen auf Nähmedien auftragen
• Material für die Subkultivierung von Cos-7-Zellen. Stoffe/Medien und ihr Sinn HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Aufrechterhaltung der Osmolalität (Wasser) und des pH-Wertes Wegwaschen zweiwertiger Kationen (Ca/Mg), die die Zelladhäsion fördern sowie überschüssiger Proteine --> Erleichtert Trypsinierung Trypsin EDTA Trypsin spaltet u. a. Zelladhäsionsproteine --> Lösung der Zellen vom Kulturgefäß EDTA komplexiert für die Bindung benötigte Kationen (Ca/Mg)  DMEM-H (Dulbecco's Modified Eagle Medium - High Glucose) = Nährmedium Glukose = Nährstoff, Substrat Phenolrot = pH-Indikator (rot --> gelb bei saurem pH) FCS = fetales Kälberserum --> Wachstumsfaktoren PS = Penicillin, Streptomycin --> Schutz vor Bakterienbefall stoppt Tryspinierung
• Versuchsziel: Transfektion Einbringen von Fremd-DNA in die subkultivierten Cos-7-Zellen und damit in eukaryotische Zellen Transformation = Fremd-DNA-Eintrag in Prokaryoten Transfektion = Fremd-DNA-Eintrag in Eukaryoten
• Was ist unter Transfektion zu verstehen? Welche zwei Arten gibt es? Einbringen von Fremd-DNA in eukaryotische Zellen zeitweiliges Einbringen eines Plasmids in die Wirtszelle = transiente Transfektion dauerhafter Einbau in das Genom = stabile Transfektion 
• Verwendungszweck Turbofect Transfektions-Reagenz enthält kationisches Polymer, welches kompakte, stabile und positiv geladene Komplexe mit der DNA bildet --> Schützen die einzubringende DNA vor Degradation und erleichtern den Gentransfer in die eukaryotische Zelle auf diese Weise kann die DNA die Zellmembran durchdringen und durch einen biher unbekannten Mechanismus bis in den Zellkern vordringen
• Durchführung: Transfektion 1. Transfektionsgemisch herstellen (Inkubation bei Raumtemp.) serumfreies Medium (DMEM-H ohne FCS) --> Serum würde Komplexbildung zwischen Transfektions-Reagenz und DNAS stören Plasmid-DNA (NCAM, eGFP, NCAM/eGFP) --> sollen in die Zelle aufgenommen werden Turbofect = Transfektions-Reagenz --> enthält kationisches Polymer, welches stabile, kompakte und positiv geladene Komplexe mit der DNA bildet und sie so vor Degradation schützt --> Gentransfer in die Zelle wird erleichtert, Zellmembran kann durchdrungen werden 2. Transfektionsgemisch auf die Zellen pipettieren und Medienwechsel Platten mit bester Konfluenz (50-70 %) wurden verwendet nach Inkubation (3 h bei 37°C) bzw. Abschluss der Transfektion erfolgt ein Medienwechsel --> jetzt serumhaltiges Medium um Wachstum der Zellen zu unterstützen und das toxische Turbofect zu entfernen
• Versuchsziel: Transfektionseffizienz Sichtbarmachen der Zellkerne und der eGFP-exprimierenden Zellen (= transfizierte Zellen) durch Fluoreszenzfarbstoff, um zu überprüfen, ob und wie effizient Fremd-DNA in die eukaryotischen Zellen (Cos-7-Zellen) aufgenommen wurden Hoechst-Farbstoff --> Anfärung der Zellkerne eGFP --> fluoreszierendes Protein
• Wie wird die Tranfektionseffizienz bestimmt? Verhältnis der Gesamtanzahl der Zellen zu den transfizierten (eGFP-exprimierenden) Zellen Auszählung der Zellen insgesammt (--> besser sichtbar durch Hoechst-Färbung) Auszählung der transfizierten Zellen (--> eGFP fluoresziert grün)
• Durchführung: Bestimmung der Tranfektionseffizienz 1. Einfärben der Zellkerne mit Hoechst 33258 (bis-Benzimid) Durchführung in Sterilbank auf EIS, um Stoffwechselprozesse zu verlangsamen Absaugen des verbrauchten Mediums und Waschen mit PBS+ (Phosphatgepufferte Salzlösung) um überschüssiges Medium zu entfernen Fixierung der Zellen mit Formaldehylösung --> enthält Methanol, was die Zellen permeabel macht und so die Frabstoffaufnahme fördert (Fixierzeit muss genau eingehalten werden, weil sonst eGFP aus der Zelle diffundiert) Erneutes Waschen mit PBS+ Auftragen des Hoechstfarbstoffes auf die Zellen Inkubation im DUNKELN, damit Fluoreszenzfarbstoff nicht von Intensität einbüßt 2. Begutachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop Absaugen des Farbstoffes und erneutes Waschen mit PBS+ um Reste zu entfernen und Zellen vor Austrocknung zu schützen 20fache Vergrößerung im Hellfeld, mit grünem Filter (macht eGFP sichtbar) und mit blauem Filter (macht eingefärbte Zellkerne sichtbar)
• Warum ist NCAM nach der Transfektion nicht unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar? nur eGFP fluoreziert grün, nicht NCAM

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