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Molgen Prokaryoten (Fach) / Plasmide (Lektion)

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• 24. Beschreiben Sie die Regulation des IncFII der R Plasmide (3P) - erklärt am Beispiel R1 - besitzt die gene repA und copB sowie 3 Promotoren, die diese beiden Gene sowie die Synthese der CopA antisense RNA regulieren - RepA aktiviert oriV und damit die Replikation - CobB reprimiert PrepA - zunächst burst der Synthese von RepA -> Replikation - CoB reprimiert PrepA, RepA nur noch von einem Promotor transkribiert - PcopA exprimiert antisense-RNA CopA, CopA bindet an repA-mRNA, Komplex wird von RNA POl III geschnitten. Die Replikation wird dadurch abhängig von der Kopienzahl gestoppt
• 25. Was ist das Handcuffing oder Coupling Modell? Wie geht hier die Regulation? (2P) - es handelt sich um einen Mechanismus zur Begrenzung der Kopienzahl von Plasmiden - bei einer hohen Kopienzahl und einer hohen RepA-Konzentration kommt es zur Dimerisierung der Plasmide durch Bindung von RepA an Iteron-Sequenzen
• 26. Was sind shuttle plasmide und was ist dabei wichtig? (2P) - Shuttle-Plasmide werden als Vektoren eingesetzt um Gene zu amplifizieren und in einen Zielorganismus zu übertragen. - Es müssen Replikationsursprünge sowohl für den zur Amplifikation (häufig E. coli) verwendeten Organismus als auch für den Zielorganismus (Hefe) vorhanden sein - ebenso müssen für beide Organismen Selektionsmarker auf dem Plasmid sein.
• 27. Was ist das „rolling circle“ Prinzip? Beschreiben Sie und nennen Sie auch die Enzyme, die benötigt werden. - Prinzip bei der Plasmid-Replikation 1. Rep-Protein bindet an DSO, Einkerbung durch Basenpaarungen der IR 2.  Bruch am äußeren Strang, 3'-OH-Ende dient als Primer für die DNA Polymerase III, der Innenstrang dient als Matrize. Rep bleibt am 5'-Phosphat gebunden 3. Der eingekerbte Strang wird als ssDNA verdrängt und wird von Rep neu verknüpft. - mehrere ssDNA-Kopien möglich
• 28. Wofür sind Plasmide wichtig? - codieren für nicht-essentielle Gene - können dem Wirt Resistenzen oder die Erschließung neuer C-Quellen ermöglichen - Verbreitung über horizontalen Gentransfer
• 29. was ist DNA-Gradientenzentrifugation? Cäsiumchloridgradient - ermöglicht Trennung von Nucleinsäuren anhand ihrer Dichte - Gewinnung hochreiner Plasmide - Diese Methode basiert auf der unterschiedlichen Einlagerungsfähigkeit von linearer und ringförmig-geschlossener DNA für Ethidiumbromid. - zunächst senkrechte, dann waagrechte Orientierung
• 30. Plasmidreplikation:? Uni oder Bidirektional (Theta intermdiat) - Unidirektional: Theta und rolling circle - bidirektional: Theta - Theta-Intermediat: uni- oder bidirektional - uni: RNA-Primer und eine Replikationsgabel bidirektional: zwei Replikationsgabeln
• 31. Rolling circle replikaiton? Über welche Intermediate 1. dsDNA wird repliziert: dsDNA und ssDNA 2. komplementärer Strang zur ssDNA
• 32. Was wichtig bei Plasmiden? - Toxine - Resistenzen - alternative C-Quellen - horizontaler Gentransfer
• 33. Wer bestimmt den “host range”? narrow range: Orgi broad range: Proteine
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• 34. Wer bestimmt die Kopienanzahl und wie? - Bestimmt durch Ori - anti-sense RNA: komplementäre RNA inhibiert deren Funktion - ctRNA: inhibiert Translation von Proteinen für die Replikation - Proteine: binden an Iterons und blockieren Replikation
• 35. antisense RNA (ncRNA) – was ist das? - ist klar
• 36. Wie wird die Replikation ColE1 verwandter Plasmide reguliert? - RNA II bindet an Ori. Cleavage durch RNase H liefert Primer -> Replikation - RNA I ist eine antisense RNA und bindet an RNA II -> kissing complex -< RNA II kann keine sek. Strukturen bilden - RNA I bei hoher Kopienzahl erhöht.
• 37. Was bestimmt die Inkompatibilität bei Plasmiden? Was bedeutet das? - Prinzip, dass sich inkompatible Proteine nicht gleichzeitig in der Zelle replizieren können - verwandte Proteine mit ähnlichen Replikationskontrollsystemen inhibieren sich gegenseitig
• 39. Col Ib P9 Kopienanzahl: über Pseudoknot Formation; - DNA-RNA-Hybrid wird durch RNA II-Loops stabilisiert - RNA-RNA-Duplex verhindert Loops
• 40. Was heißt curing bei Plasmiden? Warum und wie verhindert? - curing bedeutet die Befreiung der Zelle von Plasmid - Zunächst Klassifizirung d. Plasmide - Plasmid wird mit Resistenzgen versehen und Bakterium auf Antibiotikum-freiem Medium kultiviert - Nach Vermehrung wird die Anzahl der Kolonien erfasst und anschließend werden die Bakterien auf Antibiotika-haltigem Medium ausgestrichen. Der prozentuale Anteil d. nun wachsenden Kolonien wird erfasst. Der reziproke Wert wird als curing bezeichnet, da das Plasmid dort verschwunden ist
• 41. Transkriptionsabschwächung uber asRNA? Beispiel? - repZ-Translation bei Collb-P9 wird durch verhindern der Pseudoknot-Formation der mRNA behindert
• 43. Killer loci (ho/sok System: host killing/Supressor host killing)? - hok/sok-Gene auf dem R1-Plasmid in E.coli - langlebige (20 min) hok-mRNA wird bei Zellteilung auf beide Tochterzellen verteilt und zu letalem Hok-Protein translatiert; sok-mRNA hält nur 30 sek. - R1-positive Zellen exprimieren sok sehr stark. In diesen Zellen bildet sok-mRNA Duplexe mit hok-mRNA -> Degradation - R1-negativ: Hok wird gebildet und killt die Zelle
• 44. Cre/loxP System? Erklären - Cre ist eine Rekombinase, die spezifisch loxP-Sequenzen erkennt und den Abschnitt dazwischen herausschneidet - um einen bestimmten Abschnitt zu entfernen werden loxP-Sequenzen davor und dahinter eingebaut, die dann von Cre entfernt (bei versch. Richtungen: umgedreht) werden
• 45. Was ist das Partitionierungssystem par? R1-Plasmid - stellt sicher, dass bei Zellteilung beide Zellen ein Plasmid erhalten - Proteine ParM und ParC sowie cis-acting site parC - ParR-parC-Komplex fungiert als nuclealation site - dort bindet ATP-ParM - ADP-ParM polymerisiert und separiert die beiden Plasmide
• Was ist das besondere an Expressionsvektoren? - pET Expressionsvektor - trägt starken lac-Promotor, der durch IPTG induzierbar ist, dieser kodiert für virale T7-Polymerase - starker Promotor + gute Regulierbarkeit
• Cosmid Vektor? - klein und kann daher Segmente bis 46 kb aufnehmen - enthält cos-Gen -> kann große DNA-Insertionen in eine virale Hülle packen -  virale Hüllen können genutzt werden, um passenden bakteriellen Wirt zu finden - Cosmid wird zu bakteriellem Plasmid
• BAC (bacterial artificial chromosome) Vektoren? Based on F1 Plasmid - Vektor für große DNA-Insertionen von über 300kb
• Was sind shuttle Plasmide? Was ist dabei wichtig? - Plasmid mit mehreren Replikationsursprüngen für verschiedene Wirte

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