Mikrobiologie (Fach) / Praktikum (Lektion)

Methoden, Nährmedien..

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• Pilze - Bedeutung im Alltag Nahrungsmittel Modellorganismen (am bekanntesten S. cerevisiae) Symbionten (Mycorrhiza, Flechten) Zerstörer von organischem und anorganischem Material (z.B. Hausschwamm) Teilweise Toxinbildner (z.B. Aspergillus-, Penicillium-, Fusarium-Arten) Pathogene (Pflanzen, Tiere, Menschen) Biotechnologie (Enzyme, Antibiotika)
• Pilze - Charakterisierung Eukaryonten (echter Zellkern) Kein Chlorophyll, nicht zur Photosynthese befähigt Aerobier ("Schimmelpilz"), Cytoplasmamembran enthält Ergosterin (Ergosterol) Zentrales Strukturelement der Zellwand: Chitin, (Cellulose) Anaerobe Bedingungen: z.T Gärung, Wachstumshemmung; Energiegewinnung durch Ab-/Umbau organischer Verbindungen (heterotroph) Häufig Bildner sekundärer Stoffwechselmetabolite, z.B. Antibiotika, Mykotoxine Wachsum unter extremen Milieubedingungen möglich
• Gattung Rhizopus - Charakteristika Zygomycet, "Köpfchenschimmel" Unseptierte bis wenig septierte Hyphen Hohes weißgraues bis braunes Luftmycel, Sporangien mit dem Auge sichtbar In den Sporangien Bildung von Sporangiosporen Rhizopus-Arten sind psychrophil (-10°C) Technologische Verwendung: z.B. asiatische Fermentationsprodukte wie Tempeh Verderbniserreger: Weichfäule (Gemüse); Fleischverderb
• Aspergillus spp. - Teschnologie Produktion A. wentii: Amylase, Protease A. niger: Milch- und Zitronensäure; Antibiotika Verschiedene Aspergillus-Arten: Asiatsiche Fermentationsprodukte (Tempeh- und Tofu) Verderb A. niger: Schwarzfäule bei Weintrauben Aspergillus-Arten: Lagerpilze des Getreides
• Pilze - Vermehrung Vermehrung durch Teilung, Sprossung und/oder Hyphenbildung; viele Pilze könne sich sowohl asexuell als auch sexuell vermehren Sexuelle Fortpflanzung: perfekte / holomorphe / telomorphe Form, auch Hauptfruchtkörper Asexuelle Fortpflanzung: imperfekte / anamorphe Form, auch Nebenfruchtform Telemorphe und anamorphe Stadien haben underschiedliche NamenGattung Aspergillus (anamorph); Gattung Eurotium (telemorph)Gattung Penicillium (anamorph); Gattung Eupenicillium Talaromyces/Emericella/Hamigera (telomorph) Fungi imperfecti: Hauptfruchtformen nicht bekanntKEINE MONOPHYLETISCJE GRUPPE!
• Penicillium spp. - Technologie Produktion P. notatum; P. chrysogenum: Antibiotika P. roqueforti, P. cambertii: Käseherstellung P. nalgiovense: italienische und ungarische Rohwurst Verderb P. verrucosum: Lagerpilz bei Getreide (mykotoxine!) P. italicum: Gelb- und Blaufäule bei Zitrusfrüchten
• Gattung Geotrichum - Charakteristika Ungeschlechtliche Vermehrung durch Arthrosporen, die durch Fragmentierung der Hyphen entstehen Dichotome Verzweigung Technologische Verwendung:Käseherstellung: Harzer, Butterkäse, Camembert, Brie Verderb: häufig bei Milchprodukten
• Mikroskopie - Don't do! Wasser, MOkulturen direkt mit dem Mikroskop, insbesondere dem Objektiv und Okular in Verbindung bringen Mit scharfkantigen Gegenständen am Mikroskop arbeiten Mit Papierhandtüchern Okulare oder Objektive reinigen Mikroskop ruckartig/grob verschieben/bewegen Ohne Rücksprache den Kondensor verstellen oder kählern
• Nährmedien Flüssiges / Festes NM Komplexes / synthetische NM Vollmedium / Minimalmedium Universalnährmedium / Selektivnährmedium Differantialnährmedium
• Herstellung eines typischen Nährmediums Wasser Komplexe oder synthetische Zusätze pH-Wert ggf. Wachstumsfaktoren
• Nährmedium - Wachstmsfaktoren Prototrophe MO ("die ursprünglichen") anorganische Salze C- & Energiequelle, z.B. Glucose Auxotrophe MO ("die Hilfbedürtigen") Benötigen zusäzulich einen oder mehrere Wachstumsfaktoren Organische Verbindungen, die von der Zelle nicht synthetisiert werden können Bsp: Milchsäurebakterien Makroelemante Essenziell für alle MO C, N, O, H, S, P, Fe, K, Mg, Ca, Na Mikro- oder Spurenelemente Werden in kleinsten Mengen (10-6 bis 10-8 mol/L) benötigt Werden nicht alle von allen MO benötigt Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, V, B, Cl, Se, Si, W
• Agar zur Verfestigung von Nährmedien Aus Rotalgen Bausteine: Galaktose, Sulfat Gereinig atoxisch für MO Wird nur von wenigen bakteriellen Enzymen abgebaut
• Inkubationstemperaturen Unterscheidung von mesophilen, psychrophilen, psychrotrophen, thermophilen, extrem thermophilen, hyperthermophilen MO Typische Inkubationstemp.: Umwelt-MO: 20-30°C Bakterielle Verderbniserreger (Lebensmittel): 30°C Bakterielle Krankheitserreger: 37°C Hefen/Schimmelpilze: 25°C
• Inkubation - Verhältnis zum Luft-O2 Aerobe Bakterien (~21% Luft-O2) Mikroaerophile Bakterien (<21% L.; zB Campylobacter, Spirillum) Strikt anaerobe Bakterien (O2-Abwesenheit, zB Desulfovibrio, Clostridium) Aerotolerante Bakterien (Energiegewinn durch Gärung; zB Milchsäurebakterien) Fakultativ anaerobe Bakterien (zB Enterobacteriaceae), viele Hefe-Pilze
• Sterilisation - Autoklavieren Was? Nährmedien leere Glaswaren, Flaschen, Schläuche, Pipetten, Pipettenspitzen mikrobiologischer Abfall Sterilisatinsindikator = Kontrolle Wie? Sterilisation mit unter Druck stehendem, gesättigten Wasserdampf 121°C, 20min, 2,0 bar (Standard-Verfahren)
• Sterilisation - Filtration Abtrennung von MO aufgrund von Größenunterschieden i.d.R. Cellulosemischester Porendurchmesser zur Abtrennung von Bakterien: zB 0,2µm Häufig verdendet zur Sterilisation von hitzeempfindlichen Nährbodenzusäzuen (Wachstumsfaktoren)VitamineAntibiotika
• Rodac-Plates Recovering organisms detecting and countin Konvexe Nähragaroberfläche Kontaktverfahren, Direktisolierung 5s Kontakt
• Gewinnung von Reinkulturen Verdünnungsausstrich Physiologische, biochemische, genetische Untersuchungen an Populationen, nicht an einzelnen Zellen Notwendigkeit von Reinkulturen Reinkultur: Population, die sich idealerweise aus einer Einzelzelle (bzw. dem kleinstmöglichen Zellverband) entwickelt hat
• YGC - Yeast-Glucose-Chloramphenicol Agar Selektivagar Chloramphenicol = Antibiotikum zur Zählung von Hefen und Schimmelpilzen in Milch und Milchprodukten
• King B-Agar - KB wird als Bestätigungstest für den Nachweis von Pseudomonas aeruginosa in Trinkwasser und anderen Proben eingesetzt Diffentialmedium Pseudomonas aeruginosa ist in der Lage, verschiedene Pigmente zubilden. Die am häufigsten vorkommenden Farbstoffe sind dasblaugrüne Pyocyanin und das gelblich fluoreszierende Fluoreszein.Seltener treten Pyomelanin (schwarz-bräunlich) und Pyorubin (rötlich)auf
• Sterilisation / Desinfektion Sterilisation Komplette Eliminierung oder Zerstörung alles lebensfähigen MO einschließlich der Bekteriensporen sowie Viren Desinfektion Abtötung / Inaktivierung der meisten MO bzw. aller pathogenen MO mit Ausnahmer der Bakteriensporen
• Luftuntersuchung Welche MO sind in der Luft? Bakterien-Sporen zB von Bacillus- und Clostridium- Arten Farbige (=pigmenthaltige) Hefen, zB Rhodotorula Farbige (=pigmenthaltige) Bakterien, zB Micrococcus, Flavobacterium, Sarcina, Corynebakterien, Mycobacterium Sporen von Schimmelpilzen, zB Mucor, Rhizopus, Penicillium, Aspergillus, Cladosporium Pigmente von MO Bsp: Gelbe Kolonien: Sarcinaxanthin, Carotin-DerivatBsp: Micrococcus luteus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Rhododorula Rote KolonienProdigiosin, Pyrrol-Derivat; Bsp: Serratia marcescensPulcherrimin, Pyrazin; Bsp: Rhodotorula Bläuliche Kolonien: Pyocyanin, Phenazin-DerivatBsp: Pseudomonas aeruginosa
• Makroskopische Beschreibung - Kolonietypen Kolonieformrund, wurzelartig, unregelmäßig, filamentös, spindelförmig Randganzrandig, gewellt, gelappt, gekerbt, wurzelartig, filamentös Höheflach, erhaben, konvex, polsterförmig, gebuckelt Größewinzig, klein, mittelgroß, groß Strukturglatt, rau Aussehengöänzend, matt Pigmentierungnicht pigm. (weiß, bräunlich, cremefarben), pigm. (purpurfarben, rot, gelb) Lichtabsorbtionopak, durchscheinend, transparent
• Gramfärbung - Ablauf Fixierung Kristallviolett Logol'sche Lösung, Iodkomplex Differenzierung: Entfärben mit EtOH Gegenfärbung mit Safranin
• Methode der Anreicherung Entwicklung Winogradsky, Beijerinck: Ende 19 Jh. Anzureichender Organismus nur in geringer Konzentration vorhanden Festlegung selektiver Umweltbedingungen für den zu selektierunden Organismentyp Schaffung einer künstlichen ökologischen Nische durch:Auswahl vorzugsweise flüßiger (Selektiv-) NährmedienBebrütungsbedingungen (temp., Licht, O2-Partialdruck) Der am besten angepasste Organismus setzt sich durch
• Azotobacter chroococcum (N2-Fixierer) Charakterisierung freilebender Stickstofffixierer Wachstum im neutralen bis leicht alkalischen Milieu (Böden, Süßwasser) Konzentration im Boden < 104 KbE/g Boden aerob gramnegativ heterotroph kann Mannit als C-Quelle verwenden
• Reinkultur - Ausstrichskontrolle Eine Reinkultur kann angenommen werden, wenn Der Kolonietypus einheitlich ist und alle Kolonien auf den Ausstrichlinien liegen und Reinkultur aer i.d.R erst nach mehrfachem (~3maligem) Ausstrich!!
• Pseudomonaden Makroskopie Bildung von fluoreszierenden Pigmenten:Pyoverdine: gelb-grünPyocyanin: blau-grün Pyoverdine haben die Funktion von Sidophoren Eisentransport in die Zelle, werden unter Eisenmangelbedingungen produziert und ausgeschieden Mikroskopisch Monopolare Begeißelung stäbchenförmig aktiv bewegend aerober gramnegativer Bakterien Sporen werden nicht gebildet oxidativer Energiestoffwechsel mit Sauerstoff als Elektronenakzeptor. Zucker werden über Entner-Doudoroff-Weg zur Energiegewinnung abgebaut
• Konservierung / Lagerung von Reinkulturen Allgemeine Vorraussetzungen an Stammhaltungsverfahren: Erhalt der Eigenschaften A. Schrägagarröhrchen: kurzfristige (ca. 6 Monate) Lebend-Aufbewahrung bzw. Stammhaltung B. Kryokultur: Kurz-Langfristige Aufbewahrung und Stammhaltung der meisten Mikroorganismen möglich
• Aufbewahrung auf Schrägagar Vorteile: Lebend-Aufbewahrung Verzögertes Austrocknen des Nährbodens Im Labor platzsparende Aufbewahrung möglich Nachteile Regelmäßiges Überimpfen notwendig (halbjähr.) Überimpfen = Komtaminationsgefahr Überimpfen = Gefahr der Selektion von Stämmen mit veränderten Eigenschaften
• Dauerkonservierung - Tiefgefrieren Glycerin oder Glas-/Keramikperlen werden mit MO beschickt; Schutzmedium: Glycerin Lagerung:<= -18°C; -70°C; .196°C (Flüßigstickstoff) Haltbarkeit: ca. 10 Jahre, z.T. länger Reaktivierung: Ausstreichen bzw. Ausbringen einer "Perle" auf festem Nährmedium ggf. auch erst Überführen in flüssiges Nährmedium, dann Ausstrich
• Saccharomyces cerevisiae Besonderheiten S. cerevisiae (=Bäckerhefe) Wahrscheinlich am längsten von Menschen biotechnologisch verwendeter Organismus Eukaryontischer Modellorganismus (Genetik, Zellbiologie) Ertser eukaryontischer Organismus der vollständig sequenziert wurde (1996) Eukaryontischer Wirt zur Expression von Fremdgenen Biotechnologische Nutzung (z.B. Insulinproduktion) Mikroskopie Hefe, Eukaryont, Ascomycet Zellkern nicht zu sehen Gut zu sehen: Vakuole (Polyphosphate), Lipidtröpfchen (kontrastreich im Phaco) Hefezellen können altern; an Absprossungspunkten Narben sichtbar, nach bestimmter Anzahl von Sprossungen stirbt Zelle ab rund bis oval Durchmesser von 5-10µ vermehren sich durch Knospung
• Berechnung der Zellzahl Thomakammer Kleinquadrat: Kantenlänge 0,05mm → Fläche 0,0025mm² Volumen nach Auflegen des Deckglases:Höhe: 0,1mmVolumen: 0,00025mm³0,00025mm³ x 4 x 106 = 1cm³ = 1mL 1 Hefezelle / Kleinquadrat = 4 x 106 Hefezellen/mL 1 Hefezelle / Großquadrat = 4 x 106 Hefezellen/mL dividiert durch 16
• Direkte Zellzahlbestimmung: Lebendzellzahl Verdünnungreihen erstellen Spatelplattenverfahren = 0,1mL Probe auf Agar ausspateln (Drigalski-Spatel)Oberflächenkolonien Gussplattenverfahren = 1,0mL Probe mit Agar in Platte vermischtOberflächenkolonien + Kolonien unterhalb der Oberfläche
• Indirekte Zellzahlbestimmung: Trübungsmessung Im Photometer wird Licht durch eine Zellsuspension geleitet Das Licht, welches nicht durch die Zellen gestreut wird, wird von der Photozelle detektiert Die Photozelle misst umso mehr Licht, je weniger Zellen in der Zellsuspension vorhanden sind Vorteile schnell einfach durchführbar Sofort relativ genaue Abschätzung der Zellzahl möglich → Wichtig, um Anschlussuntersuchungen durchzuführen Zu beachten Für jeden Organismus müssen Standardkurven ermittelt werden, um die OD-Werte innerhalb bestimmter Bereiche einer Zellzahl zuordnen zu könne Kontamianton kaum erkennbar
• Stickstoffkreislauf - N2 Fixierung stabile (inert=träge) kovalente Dreifachbindung zwischen zwei Stickstoffatomen wird gespalten = sehr energieaufwändig wird zu Verbindungen reduziert, die reaktiver und insbesondere bioverfügbar sind Heterocysten = Zellen in denen enzymatische Fixierung des Luftstickstoffs durch das Enzym Nitrogenase stattfindet Nitrogenase = Enzymkomplex → elementaren, molekularen Stickstoff (N2) zu reduzieren (Dinitrogenase und Dinitrogenase-Reduktase) Reaktion findet in der Dinitrogenase statt, die Reduktase überträgt die Elektronen aktive Zentrum der Dinitrogenase besteht aus einem weiteren [8Fe-7S]-Eisen-Schwefel-Cluster, sowie dem Eisen-Schwefel-Molybdän-Cofaktor (FeMoCo) frei lebende Bodenbakterien wie Azotobacter, Azospirillum, Beijerinckia und Derxia N2-Fixierung wird durch O2 inhibiert → Nitrogenase O2-empfindlich! = Schleimkapselbildung
• Azotobacter chroococcum Mikroskopische Merkmale überwiegend paarige stäbchen Enden "dreieckig" ansonsten pleomorph relativ groß (∅ 1-2µm, L 2-10µm) meist unbeweglich Speicherstoffe: Polyhydroxybuttersäure (PHB), stark lichtbrechend Zysten: ältere Präparate, dickwandige, kugelige-ovale Strukturen CaCO3 - Zusatz Zusatz von CaCO3 als "Alkalireserve" A. chroococcum bevorzugt Alkalisches Milieu (pH 7,0-7,8, pHmin 5,5-6,0) Bildung großer Säuremengen ("Begleitflora") während des Wachstums:Ca-Carbonat (unlöslich) → Hydrogencarbonat (löslich) → CO2 (flüchtig → pH steigt Neutralisation der Säuren unter Bedingung ihrer Calciumsalze Koloniemorphologie Schleimige Kolonienjunge Kolonien: glatt, glänzend, wasserklarältere Kolonien: matt, rau, runzelig/körnig, z.T. bäunich (Melanine) keine Säurebildner Kapsel Heteropolysaccharide - Alginate (α-1,4glykolytisch verknüpfte Mannuron- & Guluronsäuren) Bedeutungnicht lebensnotwendigin gewissen Maß Schutz vor AustrocknungSchutz vor PhagozytoseAnlagerung von Antikörpern erschwert
• Lebend-Zellzahlbestimmung - Poissonverteilung Vorraussetzung: Zellen oder Kolonien sind zufällig im bzw. auf dem Nährboden verteilt und dürfen sich nicht gegenseitig beeinflussen Poissenverteilung: Wahrscheinlichkeit für die Beschreibung von Zufallsprozessen bei Zählungen Dient als Näherung der Binomialverteilung, wenn das bei der Zählung registrierte Vorkommnis sehr selten ist (=geringe Eintrittswahrscheinlichkeit p), die Gesamtzahl  n der zu zählenden Größen aber groß ist
• Berechnung der Lebendzellzahl Gewogenes arithmetisches Mittel Cgew (gewogenes arithmetisches Mittel der Koloniezahlen)=  Summe der Kolonien aller Petrischalen, die zur Bestimmung herangezogen werden (i.d.R. die niedrigste und nächst höhere auswertbare Verdünnungsstufe) diviediert durch: (n1 x w1) + (n2 x w2)+..(Anzahl der Petrischalen der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe x wichtung der niedrigsten Verdünnung, die berückstichtigt wurde) + (Anzahl der Petrischalen der nächst höheren Verdünnungsstufe x wichtung der nächst höheren Verdünnung, die berücksichtigt wurde multipliziert mit: x dFaktor der niedrigsten ausgewerteten Verdünnungsstufe
• Nachweisgrenze rein Rechnerisch gibr an, ab welcher Konzentration von MO in einer Probe ein Nachweis mit einem bestimmten Verfahren möglich ist Spatelplattenverfahren:(flüssige) unverdünnte Probe 10KbE/g bzw, 1:10-verdünnte (feste) Probe 100KbE/g bzw mL Gussplattenverfahen(flüssige) unverdünnte Probe 1KbE/g bzw mL, 1:10-verdünnte(feste) Probe 10KbE/g bzw mL Gesamtzellzahl ↔ Lebenszellzahl ↔ Optische Dichte
• Milchsäurebakterien - Charakterisierung Vorkommen: Pflanzen, Schleimhäute Morphologisch uneinheitlich (Stäbchen, Kokken) Grampositive Bakterien Vorwiegend unbeweglich Aerotolerant Anaerobier, mit wenigen Ausnahmen Katalase-negativ Energiegewinnung durch Gärung Homofermentative Arten: Gärungsprodukt Milchsäure Heterofermentative Arten: Gärungsprodukte zB Milchsäure, Ethanol, CO2 Keine Sporenbildner, Ausnahme: Sporolactobacillus inulinus
• Anaerobe Bebrütung Hohe Schicht Overlay-Verfahren + ggf. ergänzende Verfahren Randvolles Befüllen von Schraubdeckelflaschen Anaerobentopf (und anderen verschielßbate Behälter)
• Anaerobentopf Teststreifen anbringen = Methylenblau - oxidierte Form: blau (aerob)reduzierte Form: farblos (anaerob) Gasgenerator/Gasentwickler = Anaerocult KieselgurEisenpulverCitronensäureNatriumcarbonat →Durch Zugabe von Wasser wird dieser aktiviert, dabei reagiert der Sauerstoff mit dem Eisen zu Eisenhydroxid und durch eine Reaktion von Citronensäure und Natriumcarbonat wird Kohlendioxid erzeugt
• Bakterielle Sporenbildner Sporen bildende Bakterien Leine Gruppen von Bak ist zur Bildung von Endosporen befähigt i.d.R grampositive, bewegliche Stäbchen (Ausnahme: Sporosarcine, Kokken) Medizinische bedeutsame Gattungen: Bacillus (aerob, fakultativ anaerob), Clostridium (anaerob) Sporenbildner unterscheinden sich hinsichtlich iheres O2-Bedarfs Eigenschaften Dauerformen zur Artenerhaltung hoher Lichtbrechungsindex Wassergehalt von ca. 15% Dipicolinsäure (Pyridin 2,6-dicarbonsäure): sporentypische Substant, 15% des TM, liegt als Ca-Chelat vor hohe Hitzestabilität hohe Strahlungsstabilität (UV-Licht) hohe Robustheit gegenüber Chemikalien, Desinfektionsmitteln
• Wichtige Gattunge Sporen bildender Bakterien Obligat aerob/fakultativ anaerobBacillusSporosarcina Fakultativ anaerob Paenibacillus Obligat anaerob Clostridium Desulfotomaculum (Sulfatreduzierer) Aerotolerant Sporolactobacillus (einziges Sporenbildendes Milchsäurebakterium)
• Auslöser der Sporenbildung Mangel an Substrat Auslösung der Sporenbildung durch Nährstoffmangel oder die Anhäufung von Stoffwechselprodukten, nicht durch Austrocknung Sporenbildung auch durch destilliertes Wasser auslösbar: Fehlen einers äußeren Substrats (=Nährstoffmangel) löst Sporenbildung aus Kein obligat durchlaufendes Stadium im Lebnszyklus Selektionsprinzipien Verwendung getrockneter GartenerdeÜberwiegend Sporen und Cysten enthalte Medium Kartoffel aerobe Bereiche oberflächennah ANaerobe Bereiche im Kartoffelinneren: Parenchymzellen veratmen O2 und schaffen anaerobe, reduzierende Bedingungen
• Lactobacillus johnsonii Mikroskopie Grampositiv Stäbchenförmig Breite 0,5-1,1µm Unbeweglich Einzeln, paarweise, in Ketten Anaerob, aerotolerant Milchsäurebakterien,
• Streptococcus thermophilus Mikroskopie, vegetativer Zellen: Grampositiv i.d.R. kugelig oder oval 0,5 - 1,0 µm Unbeweglich Bei isolierung von festen Nährmedien oft stark deformiert: stäbchenförmig gestreckt, birnen-spindel- oder zitronenförmig angeschwollen
• Keinzahlbestimmung Nachweisgrenzegibt an, ab welcher Konzentration von MO in einer Probe ein Nachweis mit einem bestimmten Verfahren möglich ist Mikrobiologischer Grenzwertrechtlich Festgelegtgibt zB eine maximale zulässige Anzahl von MO/ Krankheitserregern pro Gramm Probe oder in einem bestimmten Volumen Probe anBsp. Trinkwasserverordnung
• Chinablau-Lactose-Agar Unterscheidung von Lactosevergärern und Nicht-Lactosevergärern Lactose + H2O → (durch β-Galaktosidase) D-Glucose + D-Galaktose Bei vergärung von Lactose: Säurebildung pH-Indikator Chinablau; neutraler bis basischer Bereich - schwach blausaurer Bereich - blau

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