Mikrobiologie (Fach) / Viren / Bakteriophagen (Lektion)

Viren

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• Def. Viren Viren sind genetische Elemente, die sich nicht ohne Wirtszelle replizieren können(keine Lebewesen! Nucleinsäurepartikel) Bakteriophagen = Viren der Prokaryonten Viren nutzen die Biosynthese-Maschinerie des Wirts, um die eigene Nukleinsäure zu replizieren, Virus-spezifische Proteine zu bilden und neue Viren zusammenzubauen der Weg über die m-RNA ist zwingend erforderlich für die Virenreplikation durch den Wirt. obligate intrazelluläre Parasiten können aus DNA oder RNA bestehen Virusnachkommen werden aus neu gebildeten Komponentenzusammengesetzt (Assembly) Ein neu gebildetes Virion ist ein Vehikel, mit dem das virale Genomzur nächsten Wirtszelle oder Wirtsorganismus transportiert wirdDort beginnt es den nächsten Replikationszyklus
• Woraus besteht ein Virus? Capsomere (Lipid + Proteine, Strukturproteine) Kapsid (Hülle) Genom (DNA oder RNA) Replikationsproteine, Akzessorische Proteine Virus = zellfreie, geschützte Nukleinsäure (RNA oder DNA)
• Vermehrung von Bakterien und Viren in Kultur Anpassung an die Kulturbedingungen (Lag-Phase)  logarithmische Vermehrung durch Zweiteilung Verlangsamung der Teilung nach Aufbrauchen der Nährstoffe (Sättigung) Infektöse Partikel dringen in die Zelle ein und zerfallen (Eklipse) Bildung und Freisetzung von vielen Virusnachkommen pro Zelle Ende der Wachstumsphase durch Tod der Wirtszellen
• (+)-Polarität des Viralen Genoms Bei Viren mit einzelsträngiger (+)ssRNA als Genom entspricht die Abfolge der Basen derjenigen der späteren mRNA. Bei Viren mit (+)ssRNA, die einer mRNA entspricht, wird diese direkt an den Ribosomen zu Protein translatiert
• (−)-Polarität des Viralen Genoms Bei einer (−)ssRNA erfolgt stets eine Vervollständigung zu einem RNA-Doppelstrang, dessen neugebildeter komplementärer RNA-Strang der mRNA entspricht und zu Protein translatiert werden kann.
• Symmetrie des Nukleokapsids (Prinzip: „self-assembly“) kugelig Ikosaedrisch (20 Flächen) stäbchenförmig helikal TMV Tabak Mosaik Virus
• Komplexe Strukturen insbesondere bei Bakterienviren (= Bakteriophagen) Kopf (Nucleocapsid) Schwanz Endplatte Tentakeln
• Prinzipien der viralen Reproduktion in Bakterien 1. Anheftung2. Einschleusung der Nukleinsäuren3. Replikation der Nukleinsäuren4. Synthese der Capsid-Proteine/ Zusammenbau5. Lyse
• 1. Anheftung (attachment) erfolgt über Erkennungsstrukturen auf der Zelloberfläche des Wirts (Rezeptoren) Diese sog. Rezeptoren haben eigentlich andere Funktionen (z.B. Pili und Flagellen, Transportproteine, Zellwandstrukturen etc.) und werden nur von den Viren als Erkennungsmotive für den geeigneten Wirt genutzt.
• 2. Einschleusung der Nukleinsäuren / Injektion Bakteriophagen injizieren ihre Nukleinsäuren in die Zelle, während das Kapsid außen bleibt. Die meisten tierischen Viren wandern als Ganzes in die Zelle, indem sie z.B. die Endozytose aktivieren.
• 3. Uncoating / Replikation der viralen Nukleinsäuren Das Virus befreit sich von seiner Proteinhülle und setzt sein Genom frei. Das Virusgenom wird in das Wirtsgenom integriert, transkribiert und translatiert. (Das Virus kann auch latent und nur als DNA-Sequenz abgespeichert als sogenannter Provirus in der Zelle verbleiben, so z.B. bei Herpes labialis, und den Zeitpunkt für die Replikation selbst wählen).
• 4. Synthese der viralen Proteine / Assembly (Zusammenbau) Die synthetisierten Bauelemente (Proteine, DNA/RNA) organisieren sich zu neuen Viruspartikeln. Zu unterscheiden sind die sog. „early proteins“, die für die Replikation der Nukleinsäuren erforderlich sind (z.B. reverse Transkriptase),und die sog. „late proteins“ (insbesondere die Hüllproteine) Das Virus übernimmt die Regulation der Synthese aller Makromoleküle.Dies führt oft zum völligen Zusammenbruch der zelleigenen Biosynthesewege des Wirts
• 5. Freisetzung Die Viren werden je nach Virus-Species durch Knospung (budding) oder Lysierung der Zelle freigesetzt.  Die Auswirkung der Virusvermehrung auf die Wirtszelle nennt man zytopathischer Effekt. Es gibt verschiedene Arten des zytopathischen Effekts: Zelllyse, Pyknose (Polioviren), Zellfusion (Masernvirus, HSV, Parainfluenzavirus), intranucleäre Einschlüsse (CMV, Adenoviren, Masernvirus), intraplasmatische Einschlüsse (Tollwutvirus, Pockenvirus)
• „Sichtbarmachen“ von Bacteriophagen Plaque-Assay zur Quantifizierung von Bakterienviren (=Bakteriophagen) Phagen Suspension + Top-Agar + Bakterien Suspension auf Nähragar gießen = Sandwich aus Top-Agar und Nähragar Inkubieren - Bakterienrasen mit Phagen Flecken (Viren-Plaques)
• verschiedene Viren a) Bakterienviren (Bakteriophagen)Beispiele:• ikosaedrisches DNA-Virus φX174• ikosaedrisches RNA-Virus MS2• filamentöses Virus M13• komplexe Viren T7, lambda b) Pflanzenviren c) Viroide
• φX174 (befällt E. coli) hat circuläre ss DNA mit vielen überlappenden Gene durch Nutzung eines anderen Leserahmens im gleichen Gen ergibt sich ein zweites Produkt (z.B. B, E) Überlappende Gene – zwei verschiedene Leserahmen ss DNA wird im Wirt zunächst in ds DNA überführt, die sog. „replizierbare Form“ (geschieht automatisch durch Enzyme des Wirts). Von der ds DNA wird die m-RNA synthetisiert; gleichzeitigwerden auch Kopien der SS DNA für die Phagenköpfehergestellt
• Filamentöses Virus M13 (6 x 860 nm) mit ss DNA (circulär) DNA Replikation wie bei φX174 Das besondere ist die Form und die Tatsache, daß der Wirt bei derFreisetzung nicht abgetötet wird. Freisetzungsmechanismus von M13: Die „Verkleidung“ mit Hüllprotein erfolgt beim AusschleusungsprozessPartielle Lyse der Mureinschicht durch Protein E
• MS2 gehört zu den ss RNA + Phagen, die Enterobakterien befallen (Pili als Rezeptoren) MS2 Synthesecyclus: Synthese - ssRNA aus +ssRNA mittels Replicase und anschließende Replizierung der + ssRNA mittels –ssRNA Template
• Komplexe Phagen mit linearer ds DNA T3, T7MuLambdaT2, T4
• temperenter Phage In Abhängigkeit vom Zustand der Wirtszelle und der Multiplizität der Infektion (Verhältnis Phagen/Bakterienzelle) kann es entweder zur: Phagenproduktion und Lyse der Zelle kommen (lytischer Zyklus) oder zur  Etablierung des lysogenen Zustandes kommen. In diesem Fall wird der lytischeZyklus reprimiert, der Phage wird in das Genom der Wirtszelle eingebaut und mitdem Wirtsgenom weitervererbt. E. coli-Stämme die bereits einen derartigenProphagen tragen sind gegen weitere Infektion durch λ immun. UnterStressbedingung (z.B. UV Behandlung von Wirtszellen die einen lysogenenPhagen tragen) kann der lytische Zyklus wieder aktiviert werden
• Lytischer Zyklus die Wirtszelle lysiert (aufgelöst), nachdem neue Virionen gebildet wurden. Dadurch kommt es zum Tod der Wirtszelle ("zytopathischer Effekt"). Viren mit lytischem Zyklus nennt man virulente Viren. . Nachdem die sich die Phagen-DNA zum Ring geschlossen hat, beginnt die Zelle unmittelbar mit der Transkription und Translation der viralen Gene. Dabei entstehen Enzyme, die das bakterielle Chromosom zerstören. Die Phagen-DNA übernimmt die Kontrolle über die Zelle - der Stoffwechsel wird auf die Produktion von Phagenkomponenten umgestellt. Die Komponenten werden anschließend intrazellulär zu neuen infektiösen Phagen zusammengesetzt. Auf die Anweisung der Phagen-DNA stellt die Zelle das Enzym Lysozym her, das die Bakterienzellwand auflöst.
• Lysogener Zyklus Phagen-DNA wird in das Genom des Wirtes eingebaut. Die vollendete Integration bezeichnet man als Prophage. Viren, die ihr Genom gemeinsam mit dem der Wirtszelle replizieren, werden temperente Viren genannt. Das Phagen-Genom wird an einer spezifischen Stelle in das Chromosom der Wirtszelle eingebaut (Prophage) und codiert ein Repressorprotein, das die meisten Prophagengene unterdrückt. Bei jeder der anschließend folgenden Zellteilungen wird die Phagen-DNA zusammen mit Wirts-DNA repliziert. Eine einzige infizierte Zelle kann auf diese Weise innerhalb einer kurzen Zeitspanne zur Entstehung einer großen infizierten Bakterienpopulation führen. Die Wirtszellen werden dabei nicht vernichtet. Spontan oder durch äußere Einflüsse bedingt kann die Phagen-DNA aus dem Chromosom herausgeschnitten werden und ein lytischer Zyklus beginnt, der dann den Zelltod zur Folge hat.
• Viroide (Pflanzenviren) bestehen aus cyclischer ss RNA, die Sekundärstrukturen bilden kann. Viroide bestehen auch extracellulär aus nackter RNA ohne Capsid und kodieren auch keine Proteine Die Viroid-RNA besitzt eine eigene katalytische Aktivität unter anderem auch inForm eines (Ribozym = katalytisch aktive RNA-Moleküle – eigenes Prozessieren-Zyklisierung). Pflanzen pathogen (stören Genexpression von wichtigen Genen) Repliziert durch Wirts-RNA Polymerase 150–400 Nukleotide (Pflanzenpathogen – Störung RNA Stoffwechsel
• Prionen bestehen offenbar nur aus Protein (auch extrazellulär stabil). Trotzdem infektiös und verursachen Krankeiten wie Scrapie (Schaf), BSE (Rind), Kuru und die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (Mensch)wahrscheinliches Wirkprinzip: Es gibt ein ähnliches Protein im Wirt α-helikale Form in Nervensystem und GehirnSchutz vor Radikalen, Cu2+ Prion mit ident. AS-Sequenz aber mit veränderter Struktur (β-Faltblatt; PrPSc) und „zwing“ diese Konformation den vorhanden (unschädlichen) Proteinen auf. – unlösliche Ablagerungen Die Folge ist Verlust der Funktion, Unlöslichkeit und Ausfällung in den befallenen Bereichen (Gehirn)Übertragung: Zuführung stark PrPSc-haltiges Material (Gehirn von Verstorbenen = Kuru – Tiermehl =BSE) PrPSc sehr resistent gegen feuchte Hitze (2h 131oC) trockene Hitze (1h 200 oC)
• Genetische Veränderung und "genetic engineering" Veränderung ist ein natürlicher Prozess und Voraussetzung für Evolution.  Ausgenutzt wird diese Fähigkeit im "genetic engineering"
• Mutationen und ihre Auswirkungen Missense mutation = Falsches/Sinnloses Proteion nonsense mutation = Unvollständiges Protein Silent mutation = Normales Protein
• Leserahmen-Mutationen (frameshift) Rasterschubmutation Eine Frameshift-Mutation ist eine Mutation, die eine Verschiebung des Leserasters von Genen auf der DNA verursacht  Deletion: Verlust eines DNA-Abschnitts Insertion: Einfügen eines Nukleotids oder DNA-Abschnitts
• Spontane Mutationsrate (pro Gen) Wenn die spontane Mutationsrate bei 10-10 liegt, ein Gen im Durchschnitt aus 1000 Basenpaaren besteht und 1 ml einer Kultur 109 Zellen enthält ... ... wie gross ist dann die Wahrscheinlichkeit, dass bei dernächsten Replikation ein spezifisches Gen mutiert? Antwort: Es sind 100 Mutanten zu erwarten109 Zellen x 1000 Basenpaare = 1012 Basen eines Gens
• Wie man Mutationen auslösen kann Basenanaloga Gruppe von chemischen Verbindungen, die in ihrer Struktur den natürlich vorkommenden Nucleinsäurebasen ähneln (Mutagene). können in die DNA oder RNA eingebaut werden und dadurch Punktmutationen auslösen. bekanntes Basenanaloga ist 5-Bromuracil, das sich vom Thymin ableitet, wobei die Methylgruppe durch Brom ersetzt ist. führt aufgrund einer gelegentlichen tautomeren Umlagerung zu einer Veränderung der Basensequenz. In seiner Ketoform paart es wie Thymin mit Adenin, in seiner Enolform jedoch mit Guanin. Dadurch wird das ursprüngliche Basenpaar AT zum mutierten Basenpaar GC.
• Wie man Mutationen auslösen kann Strahlung Ionisierende Strahlung führt zu Kettenbruch (über freie Radiale, z.B. OH·) um so gefährlicher, je kürzer die Wellenlänge unterhalb des sichtbaren Bereichs des Lichts  UV-Strahlung bewirkt hauptächlich Thymin-Dimere, was zu einer Strukturänderung der DNA-Helix führt und Replikation und Transkription beeinträchtigt. Ionisierende Strahlung : Einzelstrangbrüche: wird meist durch die DNA-Ligase repariertDoppelstrangbrüche: sind oft letal, da der Reparaturmechanismus überfordert ist.oxidative Basenänderungen: sind oft letal, da die Replikation geblockt wird
• Wie man Mutationen auslösen kann Chemikalien verändern Basen oder die DNA Struktur salpetrige Säure deaminiert (spaltet ab) A und CHydroxylamin reagiert mit CEthylmethansulfonat methyliert GNitrosoguanidin verknüpft DNA-SträngeEthidiumbromid interkaliert (Einlagerung) zwischen Basen
• Wie lässt sich die Mutagenizität einer Chemikalie feststellen Ames-Test (Bruce Ames) Auxotrophe Mutanten (His-) können auf einem Medium ohne Histidin nicht wachsen (Rasterschubmutation in einem Gen zur His-Synthese – Mutationen betreffen auch dieses Gen das durch Basendeletion an der richtigen Stelle zum „gesunden Genwird). Die Revertanten entsprechen der spontanen Mutationsrate Die Chemikalie bewirkt höhere Mutationsrate - Testkultur wird einem mutagenen Agenz ausgesetzt = Erhöhung Mutationsrate = mehr Revertanten
• Gen-Transfer Transformation, Transduktion, Konjugation
• Transformation Übertragung freier DNA Übertragung von genetischer Information durch Aufnahme freier DNA. Ursprünglich bezeichnet Transformatio die natürliche Fähigkeit mancher Bakterienarten, freie DNA aus der Umgebung durch ihre Zellwand hindurch aufzunehmen. In der Gentechnik wird die Transformation häufig dazu benutzt, um DNA in Zielorganismen einzuschleusen Natürliche Kompetenz (z.B. in Bacillus, Streptococus, Thermus et al.)liegt bei einer Häufigkeit von 0.1 – 1% (max. 20%).E.coli ist nicht natürlich kompetent - Ca++, Kälte oder Elektroporation
• Mechanismus der Transformation Gram-positive Bakterien binden freie DNA an einem Kompetenzprotein.  Durch Endonukleasen wird die DNA in der Länge von etwa 18kbp gespalten und einsträngig in die Zelle importiert. Der andere, übrig geblieben Strang wird durch Nukleasen abgebaut Gram-negative  Bakterien besitzen für den Import der freien DNA einen Secretin-Kanal an der äußeren Membran sowie einen DNA-Transporter an der inneren Membran. Die DNA wird zuerst durch das Secretin importiert. Schließlich wird die DNA einsträngig durch den Transporter importiert und der zweite Strang abgebaut
• Transduktion Übertragung von DNA mit Phagen Übertragung von Bakterien-DNA durch einen virulenten Bakteriophagen. Bei der Phagenvermehrung in der Bakterienzelle (lytischer Zyklus) kann es zufällig passieren, dass in einem Phagen statt der Phagen-DNA ein Stück der Bakterien-DNA eingebaut wird, die vorher, durch die Phagen-DNA gesteuert, in Bruchstücke zerlegt wurde. Infiziert diese Phage eine andere Zelle, wird die Bakterien-DNA in deren Bakteriengenom eingebaut (rekombiniert). Gelegentliches "Falschverpacken" ist ein seltenes Ereignis: 10-6 – 10-8
• Konjugation Übertragung von DNA von Zelle zu Zelle Übertragung von Teilen des Genoms von einer Spenderzelle (Donor) auf eine Empfängerzelle (Rezipient) durch direkten Zellkontakt. Übertragung von: Gene für Antibiotikaresistenzen, Toxine und Kolonisierungsfaktoren von einer für den Menschen harmlosen Spezies auf eine pathogene Spezies übertragen werden
• Mechanismus der Konjugation Nur ein Strang der DNA übertragen Donor und Rezipient erst einmal mitssDNA-Plasmid, das dann zum dsDNA Plasmid aufgefüllt wird.
• Definition: Gentechnik Gene neu kombinieren und gezielt modifizieren (gerichtete Evolution) und in das Genom eines Organismus einbringen Abgrenzung zu traditioneller Züchtung im Agrarbereich Klonen von Tieren ist keine Gentechnik!
• Klonierung gezielte Vermehrung bestimmter DNA-Abschnitte a) Plasmide als Klonierungsvektoren (i.R. Plasmide mit zwei Antibiotika-Resistenzen) Restriktionsendonukleasen aus:Sal I - Streptomyces albusBam HI - Bacillus amyloliquefaciensHind III - Haemophilus influenzaeClaI - Caryophanon latumEcoRI - Escherichia coliPst I - Providencia stuartii Vorgehensweise:Das gewünschte Gen wird mit Restriktionsenzymen aus dem Genomausgeschnitten oder mittels PCR verviefältig.Wichtig: das verwendete Restriktionsenzym muß auch im PlasmidSchneiden (hier BamH1 – siehe Plasmidkarte)Wenn es dabei eine der beiden Resistenzkassetten zerstört (hier Tet),gibt es einen zusätzlichen Vorteil, dass eine erfolgreicheLigation des Fremdgens erkannt werden kann
• PCR = Polymerasekettenreaktion Die PCR ermöglicht es, bekannte Gene zu „amplifizieren“ und zu klonieren,ohne dass bestimmte Schnittstellen vorhanden sein müssen. Es müssen nur die korrekten Primer hergestellt werden Die Primer können geschickt gewählt, so daß entsprechende Überhänge für Schnittstellen vorliegen (mit Erkennungsmotiv am Ende)
• Expression - Transkription eines Fremdgens typischer Expressionsvektor: lac-Promotor + Polylinker Amp-Resistenzgen Wenn lacZ = β-Galaktosidase intakt ist, wird X-Gal zu einem blauen Farbstoff hydrolysiert X-Gal = 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid„blau-weiss“-Screening: blau: Expressionsvektor ohne klonierte Fremd-DNA weiss: Fremd-DNA wurde erfolgreich integriert (lacZ zerstört)
• Reinigung rekombinanter Proteine - His-TAG (= Histidin-Markierung) Am N- oder C-terminalen Ende des Proteins werden ca. 6 Histidine eingeführt (z.B. dadurch, daß das Gen in einen entsprechenden Vektor mit 6 Codons für His ligiert wird) Protein mit Histidin-Peptid binden an eine sogenannte Ni-NTA-Säule (NTA = Nitriloessigsäure) alle anderen Proteine binden nicht. Protein mit Histidin-Peptid können von der Säule wieder mit imidazolhaltigen Puffern eluiert werden und sind „sauber“.
• Ausschalten von Genen Transposonmutagenese (Transposon = springendes Gen) Einführen über Plasmide Vorteile gegenüber klassischer Mutagenese: der Insertionsort (das Gen) ist lokalisierbar (z.B. Southern Blot) gezielt über Kassetten-Mutagenese Einführen über Plasmide Dazu wird z.B. eine Antibiotika-Kassette über homologe Rekombination in das Ziel-Gen auf dem Genom eingeführt. Homologe Rekombination

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