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MoMo (Fach) / Homology Modeling (Lektion)

Grundlagen MoMo

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  • Homology Modeling Vorhersage der 3D-Struktur aufgrund von Ähnlichkeiten in der Aminosäuresequenz mit bekanntem Protein (Kristallstruktur)
  • De Novo Prediction Vorhersage ohne ähnliche Struktur nur durch Sequenz, limitiert auf kleine, globuläre Amine
  • Ziel Homology Modeling Proteinmodellierung am PC mit vergleichbaren Fehlern wie bei Strukturanalysen (Röntgenkristallographie, NMR, Kryoelektronenmikroskopie)
  • Motivation Homology Modeling nur ein kleiner Teil der bekannten Sequenzen ist bisher strukturell aufgeklärt (zu groß für NMR, keine stabilen Kristalle für x-ray) Voraussetzung zur Verwendung des Homology Modeling ist mindestens 30% Sequenzidentität, v.a. in wichtigen Bereichen (z.B. Bindetasche) möglich, da 3D-Strukturelemente nur begrenzt sind (Helix, Faltblatt) und bei ähnlicher Proteinfunktion starkt konserviert (trotz evt. leicht anderer Sequenz) je größer die Sequenzidentität ist, desto geringer ist der Fehler (RMSD der Backbone-Kohlenstoffe wird immer kleiner)
  • Schritte des Homology Modeling Templateauswahl Alignment-Korrektur Modellierung Backbone Modellierung Loop Modellierung Seitenketten Optimierung Evaluation
  • Templateauswahl Vergleich der Targetsequenz mit den Sequenzen bereits aufgeklärter Proteine (PDB) arbeitet man in der safe zone, können Suchprogramme wie BLAST (basic local alignment search tool) oder FASTA verwendet werden die Auswahl des Templates ist von verschiedenen Faktoren abhängig und evt. je nach Ziel unterschiedlich biologische/biochemische Funktion ähnlich? gebundene Liganden/Cofaktoren? Auflösung/Qualität? gleiche Proteinfamilie? Sequenzidentität für jedes mögliche Template kann ein Score berechnet werden BLAST und FASTA verwenden eine Aminosäureaustauschmatrix oder eine Vergleichsmatrix
  • Alignment-Korrektur hat man mehrere mögliche Templates gefunden, muss man sich die Sequenzen genauer ansehen bei Mutationen muss darauf geachtet werden, wo diese liegt (hydrophober Kern, hydrophile Hülle) und dort möglich ist Vergleich von mehreren Sequenzen untereinander und Vergabe von positionsabhängigen Austauschscores (profiles) Lücken oder Einschübe sollen möglichst in Loop-Regionen verschoben werden, um keine Strukturelemente zu beeinflussen auch visuell anhand möglicher Strukturen kann eine Korrektur erfolgen sodass möglichst kleine "Löcher" entstehen
  • Backbone-Modellierung (SWISS-Modell) in den meisten Fällen sehr einfach wenn die Aminosäuren identisch sind, können die kompletten Koordinaten kopiert werden unterscheiden sie sich, können die Koordinaten von N, C2, C und O kopiert werden dazu sollte das Template mit den geringsten Fehlern verwendet werden es ist auch möglich, die Backbones von zwei unterschiedlichen Strukturen zu kombinieren (multiple template modeling)
  • Loop-Modellierung Lücken in Target- oder Templatesequenz müssen ausgeglichen werden dadurch entstehen immer Konformationsänderungen, die aber in Sekundärstrukturelementen nicht erlaubt sind Daumenregel: alle Lücken und Einschübe in Loops oder Turns verschieben Modellierung der Loops ist schwierig, Annäherung mit ähnlichen Loops aus PDB oder energiebasiert
  • Daumenregel Bei Modellierung der Loops alle Lücken und Einschübe in Loops oder Turns verschieben
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  • Modellierung von Seitenketten bei hochkonservierten Bereichen können Torsionswinkel kopiert werden ansonsten können Rotamer-Bibliotheken verwendet werden bestimmte Backbone-Konformationen bevorzugen bestimmte Rotamere Vorhersage im hydrophoben Kern ist recht gut Vorhersage im hydrophilen Bereich ist schwierig, selbst Experimente können keine richtige Antwort geben (Ketten werden z.B. durch Kristallkontakt beim x-Ray in ihrer Lage beeinflusst)
  • Modellierung - Optimierung Modellierung ist abhängig vom korrekten Backbone, welches wiederum von den Seitenketten abhängig ist usw. Rotamervorhersage resultiert in einer Änderung des Backbones, welche wieder eine Rotamerveränderung verursacht usw. durch Energieoptimierungen werden große Fehler, wie z.B. Clashes oder zu kurze/lange Bindungen, aufgehoben, aber auch kleine Fehler indiziert um Akkumulation der kleinen Fehler zu verhindern, werden nur ein paar Hundert Energieminimierungen durchgeführt MD-Simulationen können auch zu einer Optimierung herangezogen werden (enthält auch entropische Effekte)
  • Modellierung - Evaluation jedes Modell enthält Fehler, die Anzah der Fehler ist abhängig von: Fehler im Template Sequenzidentität  (>90% → wie experimentell ∼ 0,5Å; 50-90% → ∼ 1,5 Å; < 25% → i.d.R. zu groß) Energiekalkulationen des Modells basieren auf Kraftfeldern (Bindungslängen, -winkel, -bumps = Unebenheiten); kann nicht beantworten, ob das Protein gut gefaltet wurde, da Energieminimierungen vorher durchgeführt wurden eine zweite Möglichkeit ist der Vergleich der Charakterisitika des Modells mit der Realität stereochemische Merkmale (Bindungslängen, -winkel) allg. Strukturen/Faltungen Verteilung der polaren/apolaren Aminosäuren gibt es eine Kristallstruktur, kann auch ein RMSD-Wert berechnet werden (root mean square deviation) RMSD = √[(Σ(x1,i-x2,i)2)/n] x1-x2=√[x1-x2)2+(y1-y2)²+(z1-z2)²] sollen aus dem Modell weitere Informationen erhalten werden, ist eine genaue Evaluation unbedingt nötig
  • RAMACHANDRAN Plot stereochemische Merkmale (Bindungslängen, -winkel) allgemeine Strukturen/Faltungen Verteilung der polaren/unpolaren Aminosäuren

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