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Genetik der Pflanzen (Fach) / Praktikum2 (Lektion)

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• Analyse von Plasmid‐DNA Welche Möglichkeiten gibt es? a) PCR – Amplifikation eines DNA‐Abschnittes‐ Oligonukleotide/Primer werden benötigt‐ wenn nur Vektor‐Sequenz bekannt ist, kann man nur die Größe des inserts bestimmen‐ kloniert man eine bekannte DNA‐Sequenz, kann man mittels spezifischer Primer das Vorhandensein/Position dieser spezifischen DNA im Vektor überprüfen b) Restriktionsverdau‐ wenn nur Vektor‐Sequenz bekannt ist, kann man nur die Größe des inserts bestimmen bzw. Aussagen über vorhandene Schnittstellen treffen‐ kloniert man eine bekannte DNA‐Sequenz, kann man mittels spezifischer Endonukleasen das Vorhandensein/Position dieser DNA im Vektor anhand der erwarteten Fragmentgrößen überprüfen c) Sequenzierung‐ Oligonukleotide/Primer werden benötigt‐ man kann aus dem Vektor in das insert „hineinlesen“, um‐> die Sequenz zu identifizieren‐> den reading frame zu überprüfen (z.B. für Proteinexpression)‐> die Sequenz auf Mutationen zu überprüfen(z.B. Mutagenese)
• VORTEILE UND NACHTEILE (PCR, Restriktionsverdau, Sequenzierung) PCRVorteile• schnell: als template dienen Kolonien, Kulturen oder (geringe) Mengen an DNA• Durchsatz: screening möglich Nachteile• Aufwand: es werden Oligonukleotide benötigt (spezifisch für Vektor oder Insert)• Einschränkung: große Fragmente können Probleme bereiten RestriktionsverdauVorteile• Durchsatz: screening möglich• preiswert: Enzyme können für viele Vektoren etc. verwendet werdenNachteile• Aufwand: DNA muß zunächst in ausreichender Menge extrahiert werden SequenzierungVorteile• maximale Information Nachteile• Aufwand: DNA muß zunächst in ausreichender Qualität extrahiert werden, Oligonukleotide nötig• Kosten: meist externer Dienstleister
• Plasmid‐Extraktion / Minipräp (alkalische Lyse nach Birnboim & Doly, 1979) Bakterien in stationärer Phase (ÜN‐Kultur) werden durch Zentrifugation aufkonzentriert und dann durch ein alkalisches Millieu (pH ~12) die Zellwände aufgebrochen und Proteine+DNA denaturieren.  P1: Tris, EDTA, RNase  P2: NaOH, SDS Kalium‐ oder Natriumactetat (pH 5) neutralisiert den Ansatz, und chromosomale DNA und Proteine gehen Komplexe mit K+ und Na+ Ionen ein (Ausfällung). Die Plasmid‐DNA bleibt (länger) in Lösung bzw. renaturiert schneller (reannealing). Die Plasmid‐DNA wird durch Zugabe von Isopropanol gefällt (Entzug der Hydrathülle) und kann nun abzentrifugiert werden. Eine kurze Fällung bei auf Eis verhindert Salzausfällung (inhibierend z.B. bei Restriktionsverdau)! Das DNA‐Pellet wird mit 70% Ethanol gewaschen und anschließend in Wasser oder TE‐Puffer (Tris‐EDTA) gelöst.
• Agrobakterien: "Natürliche" Gentechnik? Agrobakterien sind gram‐negative Bodenbakterien, die durch Integration bakterieller DNA ins Pflanzengenom eine Tumorbildung auslösen. Das Bakterium besitzt ein extrachromosomales Ti‐Plasmid (Tumor induzierend). Dieses trägt neben dem Replikationsursprung (ori) die Virulenzgene (vir), die Transfergene (tra), die T‐DNA (onc, ops) und Gene für den Opinkatabolismus. Die T‐DNA (zwischen left border und right border) wird in die Pflanzenzelle eingeschleust und ins Genom eingebaut. In Bakterien mit entwaffnetem Helfer‐Plasmid wird ein binärer Vektor eingebracht, der die T‐DNA mit einzuschleusender DNA (gene of interest) trägt. Die Vir‐Region des Helfer‐Plasmids bewirkt in trans die T‐DNA Übertragung >> binäres System.
• Der Weg zur transgenen Pflanze …durch Agrobaterien‐vermittelte Transformation Die gewünschte Sequenz (z.B. orf) wird in einen geeigneten Vektor (Plasmid) kloniert ‐Plasmid in E. coli Bakterien vervielfältigt ‐Überprüfung der Sequenz ‐Klonierung in binären Vektor (T‐DNA ca. 4 kb) Binärer Vektor wird in Agrobakterien (A. tumefaciens) vervielfältigt. Agrobakterien werden zur Transformation pflanzlicher Keimzellen verwendet (indirekter Gentransfer). Samen der transformierten Pflanzen (T0) werden auf Selektionsmarker getestet, wie z.B. eine Antibiotika‐ oder Herbizid‐Resistenz ‐entstehende transgene Pflanzen heißen T1 ‐Test auf Anzahl der T‐DNA Insertionen (Segregationsanalyse) Ziel: homozygote transgene Linien
• stabile Transformation von A. thaliana DNA Sequenz in binärem Vektor : ‐LB und RB (T‐DNA) mit Promotor/Gen/Terminator und Selektionsmarker ‐Replikationsstart (ori) und Selektionsmarker für E. coli und A. tumefaciens Um eine stabile Transformation zu erreichen, müssen Keimzellen transformiert werden.* Die Blüten/Keimzellen werden in Kontakt mit Agrobakterien gebracht. Nur Blüten in bestimmter Entwicklungsphase sind kompetent.
• Extraktion genomischer Pflanzen‐DNA Die Pflanzenzellen (Zellwand, Zellmembran) werden mechanisch durch schnelles Schütteln in Gegenwart einer Stahlkugel und Extraktionspuffer aufgebrochen. ‐Extraktionspuffer: Tris‐HCl, EDTA, NaCl Die Zugabe von SDS bewirkt die Fällung von Lipiden und Proteinen, so dass Zelltrümmer, Lipide und Proteine abzentrifugiert werden können. Zügig arbeiten – genomische DNA beginnt zu denaturieren! Die Nukleinsäuren werden durch Zugabe von Isopropanol gefällt und können nun abzentrifugiert werden. Das DNA‐Pellet wird mit 70% Ethanol gewaschen und anschließend in Wasser gelöst
• Nachweis von Transgenen per PCR PCR auf T‐DNA spezifische Sequenzen, wie z.B.: ‐Selektionsmarker (Antibiotikum‐, Herbizidresistenz) ‐Promotor ‐Epitop Tabakpflanzen segregieren für Hygromycin (HPT)/Tet bzw. Kanamycin (NPT)/GUS

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