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Genetik der Pflanzen (Fach) / Praktikum 1 (Lektion)

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• Klonierung von DNA -Fragmenten Eine Klonierung ist die Einführung eines DNA -Fragments in einen Vektor, der die massenhafte Vermehrung dieser DNA ermöglicht 1.Klonierung 70er Jahre Choen Boyerund Chang Früher notwendig um ausreichende DNA zu bekommen Vorteile: als Klon DNA so Stabil und unproblematisch im Umgang >kann sie nicht verlieren Man kann DNA-Fragmenten zusätzliche eigenschaften verleihen
• Klonierung von DNA -Fragmenten ablauf was ist notwendig? Vektor Restrikonsverdau: LIgation Transformation in Bakterien Selektionsmarker PCR Gelelektrophorese
• Mit welchem Vektor-(Klonierung). Welche gibt es? Plasmidvektoren (3kb) Phagenvektoren Cosmide BACs YACs
• Was sind Plasmide. Eigenschaften Grundlagen:Plasmide sind DNA-Moleküle, welche natürlich in Bakterien vorkommen. Sie können sich unabhängig vom bakteriellen Genom in Bakterien vermehrenGrundlegendenEigenschaften sind• zirkuläre ,doppelsträngige DNA -Moleküle• beinhalten nur wenige Gene• kleineGröße ( nur wenige tausend Basenpaare )• ein Replikationsstar
• Die Minimalausstattung eines Plasmids besteht aus? • einem Replikationsstart ( origin of replication ,,ori )• einem Selektionsgen (meist einAntibiotikaresistenzgen )• einer Klonierungsstelle mit mehreren einmaligen Schnittstellen für Restriktionsenzyme (multiple cloning site )
• Restriktionsenzyme  Bakterien schützen sich vor Fremd - DNA durch Restriktionsenzyme (Restriktionsendonucleasen )  Bakerielle DNA ist durch Methylierung geschützt  Restriktionsenzyme erkennen bestimmte kurze DNA - Sequenzen
• Es gibt 3 Klassen von Restriktionsenzymen. Welche ? welche werden für die Genklonierung verwendet? Typ I Erkennen spezifische Sequenzen, schneiden aber unspezifisch, benötigen ATP Typ II Schneiden spezifisch innerhalb der Erkennungssequenz, benötigen kein ATP Typ III Erkennen spezifische Sequenzen, schneiden 20 -25 Nukleotide entfernt davon, benötigen ATP Nur Enzyme der Klasse II werden für Genklonierungen verwendet
• Verwendung der Restriktionsenzyme in der Molekularbiologie: •zur Vorbereitung einer Ligation (Herstellung von rekombinanten DNA - Molekülen, Genbibliotheken )• Überprüfung von DNA Identität• Mapping von DNA
• Palindrome Erkennungsequenz für Restriktionsenzyme vier bis sech oder acht Basenpaaren Symetrisch aufgebaut in beieden strängen gleich --> Sticky ends und blunt ends
• Ligation  Behandelt man den Vektor mit den gleichen Restriktionsenzymen wie das DNA - Fragment, so besitzen die einzelnen Moleküle beider DNAs die gleichen offenen Restriktions - schnittstellen an ihren Enden. So kann sich ein Vektormoleküls mit einem Molekül genomischer DNA durch Basenpaarung verbinden.  Diese rekombinierten Moleküle werden mit dem Enzym DNA- Ligase kovalent geschlossen. Das Standardenzym für Ligation ist die T4 DNA - Ligase  Sie ist extrem schnell und genügsam bezüglich der Pufferbedingungen.
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• Transformation in Bakterien. In welche Bakterien? Es existieren viele verschiedene Bakterienstämme mit gutcharakterisierten Eigenschaften. Da wir die Blau -weiß - Selektion nutzen möchten, brauchen wir einen Stamm, der das LacZ - Gen im Vektor komplementie
• Herstellung kompetenter Zellen und Transformation. KOMPETENZ Kompetenz : Fähigkeit  fremde DNA aufzunehmen ( ein physiologischer Zustand) Die klassische Methode, Bakterien transformationskompetent zu machen, funktioniert mit Inkubation in Calciumchlorid bei 0°C. Die kompetenten Bakterien werden dann mittels Hitzeschock transformiert. Eine weitere Möglichkeit sind Elektrokompetente Bakterien, die mittels Elektroporation transformiert werden
• Selektionsmarker z.B. Antibiotikaresistenz Blau-weiß selektion ( ß galactosidase als markergen)
• Antibiotika als selektionsmarker: Man unterscheidet folgende Wirkmechanismen. bakteriostatisch:Bakterien werden an der Vermehrung gehindertbakteriozid:Bakterien werden zwar getötet, sind aber weiterhin physisch vorhandenbakteriolytisch:Bakterien werden getötet, ihre Zellwand wird aufgelöst
• Das lac-Operon Enzyme für den Lactoseabbau werden gemeinsam und in gleicher Menge produziert,weil die Gene gemeinsam abgelesen werden. Der Operator , als regulierender Genabschnitt vor den Genen kann mit dem Repressor in Wechselwirkung treten. Vor dem Operator ist der Promotor , der DNA - Abschnitt, der die DNA - Polymerasebindet. Die DNA -Polymerasekann nur Strukturgene ablesen, wenn der Operator nicht durcheinen Repressor blockiert ist. Wenn sich ein Lactose Molekül an den Repressor bindet, verliert er dadurch seinespezifische Bindungsfähigkeit und die Transkription der Strukturgenekann erfolgen. Die Funktionseinheit von Operator, Promotor und Strukturgen wird als operonbezeichnet.
• lac operon Aktivatoren Für die Analyse kann anstelle von Lactose als Induktor ein Analogon IPTG eingesetzt werden da E.coli IPTG nicht spalten kann
• PCR: Kompenenten Ausgangs - DNA ( Template ) Oligonukleotide ( Primer ) → 2 spezifische (18 - 25 bp ) hitzestabile DNA - Polymerase (z.B.Taq - DNA - Polymerase ) Desoxynucleosidtriphoshate ( dATP,dCTP ,dGTP , dTTP = dNTP s ) DNA - Polymerase benötigt einen speziellen Reaktionspuffer PCR - Apparat ( Thermocycler ), der nach einem programmiertenMuster die erforderlichen Temperaturwechsel durchführen kann
• Gelelektrophorese Elektrophorese = Wanderung geladener Teilchen im elektrichen Feld Agar Gel aus Agarose und Agaropektin Agarose:Lineraes Polymer der Agarbiose, ca. jede 10 Rest sulfatier(ester) AgaropektinHöhererVeresterunggrad auch verzweigungen
• Womit wird die DNA bei der Gelelektrophorese sichtbar gemacht? Färbung der DNA mittels Ethidiumbromid Dieser Farbstoff kann sich zwischen die nt Basenstapel der DNA schieben, man nennt das interkalieren. Der Farbstoff leuchtet orange, wenn er mit UV- Licht angeregt wird. Das Besondere ist jedoch, dass er wesentlich intensiver leuchtet (50 - 100) mal, wenn er in DNA interkaliert ist, als wenn er frei vorliegt -->Krebsterregent
• Analyse von Plasmid‐DNA ‐ 1 Welche Möglichkeiten gibt es? a) PCR – Amplifikation eines DNA‐Abschnittes‐ Oligonukleotide/Primer werden benötigt‐ wenn nur Vektor‐Sequenz bekannt ist, kann man nur die Größe des inserts bestimmen‐ kloniert man eine bekannte DNA‐Sequenz, kann man mittels spezifischer Primer das Vorhandensein/Position dieser spezifischen DNA im Vektor überprüfenb) Restriktionsverdau‐ wenn nur Vektor‐Sequenz bekannt ist, kann man nur die Größe des inserts bestimmen bzw. Aussagen über vorhandene Schnittstellen treffen‐ kloniert man eine bekannte DNA‐Sequenz, kann man mittels spezifischer Endonukleasen das Vorhandensein/Position dieser DNA im Vektor anhand der erwarteten Fragmentgrößen überprüfen

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