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Genetik der Pflanzen (Fach) / Vorlesung 3 (Lektion)
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- 2.)Funktionelle Domänen von Transkriptionsfaktors Ein Transkriptionsfaktor hat mehrere distinkte und funktionell wichtige Domänen:- DNA-Bindedomäne (DBD)- Aktivierungsdomäne (AD)- Kernlokalisationssequenz (NLS)- Weitere Domänen zur Interaktion mit Effektoren (meist andere Proteine, seltenkleine Moleküle)
- 2.1.) Transkriptions-Familien Transkriptionsfaktoren werden anhand der strukturellen Ähnlichkeit ihrer DBD in Familien und Superfamilien eingeteilt. Große Transkriptionsfaktor-Familien sind : AP2/ERF, bHLH, Zn-Finger, MYB, WRKY, NAC
- 3.)Wichtige Domänen von Transkriptionsfaktoren die in Kontakt mit der DNA-dopelhelix treten: Helix-turn-Helix Luecine Zipper Zinc finger Die DNA-Bindedomänen vermitteln die Spezifität der DNA-Protein-Interaktion.
- 3.1.)Das Helix-Turn-Helix-Motiv Bildet 3 helixe Helix 3 tritt in der Großen Furche in Kontakt mit der DNA, Helix 1 und Helix 2 liegen außerhalb der DNA. I-I
- 3.2.)Der Leucin-Zipper ist eine Domäne, die Protein-Protein-Interaktionen ermöglicht Die basischen Regionen des sogenannten bZIP-Motifs interagieren mit der DNA. Die basischen Regionen von zwei Proteinen werden durch die Interaktion von hydrophoben Leucin-Resten („Leucin-Zipper“) zusammengehalten und korrekt orientiert.
- 3.3.)Das Zn-Finger-Motiv Meist kommen in einem Protein mehrere Zn- Finger gemeinsam vor, . Die α-Helix auf der C-terminalen Seite bindet in der großen Furche an die DNA.
- 4.)Die Aktivierungsdomäne von Transkriptionsfaktoren Die Aktivierungsdomänen (AD) von Transkriptionsfaktoren sind weniger gutcharakterisiert als die DBD. Sie sind meist reich an sauren, d.h. negativ geladenenAminosäuren (Asp, Gln) oder (seltener) reich an Glutamin oder Prolin. Die AD weisen eine geringe Spezifität auf, die AD verschiedener Transkriptionsfaktoren sind häufig austauschbar. AD beeinflussen die Anlagerung des Transkriptionskomplexes an den Promotorund verstärken somit die Transkriptionsaktivität eines Gens. Der genaueMechanismus, wie sie zur Aktivierung der Transkription beitragen, ist allerdingsunklar.
- 5.)Wie kann Aktivität von Transkriptionsfaktoren reguliert werden ? Regulation der Neusynthese des Transkriptionsfaktors,z.B. durch positive oder negative Regulation an dessen eigenem Promoter. Aktivierung oder Deaktivierung des Transkriptionsfaktors durchPhosphorylierung bzw. Dephosphorylierung. Aktivierung (bzw. Freisetzung) durch Bindung eines Liganden (Effektors). Aktivierung (bzw. Freisetzung) durch den Abbau eines Inhibitors.
- 5.1..)Cytokinin-Signalübertragung Die Transkriptionsfaktoren der Cytokininantwort sind sogenannte Typ B-Responseregulatoren, die zur Myb-Klasse der Transkriptionsfaktoren gehören. Sie werden durch Phosphorylierung aktiviert. Das Signal für die Phosphorylierung gelangt über einen sogenannten „His-to-Asp-Phosphorelay“von membranständigen Cytokininrezeptoren durch Phosphotransmitterproteine in den Zellkern. siehe folie 14
- 5.2.) Auxin-Signalübertragung Normalerweise werden Auxin-Responsefaktoren (ARF) durch kleine Proteine (Aux/IAA)inhibiert, es findet dann keine Transkription von Auxin-Antwortgenen statt. Auxin vermittelt die Bindung von Aux/IAA an einen Proteinkomplex (SCF-TIR; TIR ist ein Auxinrezeptor), der Aux/IAA mit Ubiquitin (Ub) für den Abbau markiert. Dadurch werden ARFs freigesetzt und können nun Auxin-Antwortgene aktivieren. siehe folie 15
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- 6)Wie wird der Promoter eines Gens funktionell analysiert? Die Analyse von Punktmutationen im Promoter und den upstream-regulatorischen Regionen (= in 5´-Richtung oder stromaufwärts gelegen) zeigt, daß nur Mutationen in den konservierten Boxen zu einer starken Reduktion der Transkriptionsaktivität führen Funktionell wichtige Bereiche im Promoter können durch Mutation identifiziert werden. Promoter-Deletionsanalyse
- 6.1.) Promoter-Deletionsanalyse Die Deletionsanalyse ist ein Standardverfahren, um funktionell wichtige Promoterbereiche zu identifizieren. Dabei werden sukzessive größere Abschnitte aus dem Promoter entfernt und die Promoteraktivität mit Hilfe eines Reportergens gemessen. Verlust der Antwort auf einen bestimmten Stimulus bedeutet das funktionell wichtige Sequenzen deletiert wurden. siehe folie 18
- 7.)Der Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Prinzip der EMSA‐Methode Beim Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) erzeugt die Bindung von Kernproteinen an die DNA ein verändertes Laufverhalten (´Shift´) in einem Polyacrylamidgel. Die DNA wird radioaktiv markiert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Im EMSA werden typischerweise DNA-Abschnitte getestet, die zuvor durch Deletionsanalyse identifiziert wurden.
- 8.)Yeast One‐Hybrid‐Methode Yeast One-Hybrid ist eine genetische Methode, um Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die an eine bestimmte DNA-Sequenz binden. Die DNA-Sequenz (hier Response-Element T) wird in ein Plasmid vor einen Minimalpromoter und das HIS3 Gen inseriert sowie in einen Hefestamm transferiert, der nur ein defektes HIS3 Gen besitzt. Dieser Stamm wird mit einer Genbibliothek transformiert,die Fusionen von DBD mit der AD des GAL4 Faktors enthält, und auf Medium ohne Histidin ausplattiert. Vermittelt die DBD des Fusionproteins GAL4-AD-DBD eine Bindung an die Zielsequenz (T), so kann die Hefezelle ohne Histidin wachsen.
- 9.EMS EMS wird bei Arabidopsis samen als Mutagen benutzt welche wiederrum in der Vorwärtsgenetik benutzt werden Es ist ein Alkylierungsmittel ( hauptsächlich auf G) zur Änderung der Basenpaarung und verursacht vorallem Punktmutationen (transitions) .