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Genetik der Pflanzen (Fach) / Vorlesung 2 (Lektion)

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• 1.) Genetischer Infomationfluss DNA--------------> RNA---------------> Protein       Transkription         Translation
• 2)Struktur eines typischen eukaryotischen Pflanzengens. Upstream regulatory Promoter( CAAT-box TATA-box) Transkriptet region siehe folie 3
• 2.1.)Die häufigsten konservierten regulatorische Sequenzmotive in A.tahliana Die häufigsten konservierten regulatorische Sequenzmotive in derproximalen 5'-upstream Region von Genen sind bei Arabidopsis thaliana dieGC-Box, die CAAT-Box und die TATA-Box siehe folie 4
• 2.2.)Transkriptionsinitiation durch RNA Polymerase II Eukaryontische Promotoren werden zuerst von "allgemeinen Transkriptionsfaktoren (TFs)" TBP/TFIID, TFIIA, -B, -F, -E und -H erkannt Diese bilden den Präinitiationskomplex Dabei bindet das TATA-Box Binding Protein (TBP) an die TATA-Box Die RNA-Polymerase II bindet nicht direkt an den Promoter (wie bei Bakterien), sondern an die Proteine des Präinitiationskomplexes Das Startsignal für den Beginn der Transkription ist die Phosphorylierung der CterminalenDomäne (CTD) der RNAPolymerase II durch TFIIH.
• 2.3.)Für die Transkriptionsinitiation in vivo werden zusätzliche Proteine benötigt: Transkriptionsaktivatoren (spezielle Transkriptionsfaktoren), der Mediator-Komplex, der Aktivatoren (oder Repressoren) mit dem basalen Transkriptionskomplex verbindet und diesen so reguliert. Nucleosomen-modifizierende Enzyme (Chromatin remodeler; HAT, Histonacetylasen)
• 2.3.1)Die Regulation der Transkription bei Eukaryonten involviert viele Proteine: DNA-biegende Proteine bringen weit entfernte Transkriptionsaktivator-Bindestellen (Enhancer) zur RNA Pol IITranskriptionsaktivatoren steuern dieentwicklungsspezifische,gewebespezifische unddurch externe Stimuli induzierte Transkription
• 2.3.3)Regulatorische Schritte bei der Realisierung der genetischen Information DNA---------------> prä-mRNA-------------------------> mRNA------------------> Protein        Transkription                Splicing, Capping,Tailing        Translation • Zugänglichkeit der DNA• Initiation der Transkription • Regulation der mRNA-Reifung • Transport in das Cytoplasma• Stabilität der mRNA • Posttranslationale Modifikationen• Proteinstabilität
• 2.3.5.)Was passiert mit den Nucleosomen bei der Transkription? Nuclesomen löstsich auf und ensteht an einer neuen stelle
• 3.)Einige Kriterien für die Identifizierung eines Gens aus der Sequenz in silico In einem der sechs Leseraster muss ein Startcodon vorhanden sein. Bis zum ersten Stoppcodon muss ein ausreichend langes Offenes Leseraster (Open reading frame, ORF) vorhanden sein (d.h. eine ununterbrochene Abfolge von Triplettcodes), um ein - zumindest kleines - Protein zu kodieren. Mögliche  Introns sind zu berücksichtigen.  In 5´-Richtung vom ATG sollten typische Promotersequenzen vorhanden sein, u.a. bei den meisten Genen eine TATA-Box.  In 3´-Richtung sollten Sequenzen vorhanden sein, die für die Termination der Transkription und die Polyadenylierung wichtig sind.  Im vorhergesagten Transkipt bzw. Gen können (müssen aber nicht) die Konsensussequenzen von Intron-Exon-Grenzen vorhanden sein. Hilfreich können Vergleiche mit bekannten paralogen oder orthologen Genen aus dem gleichen bzw. anderen Organismen sein. Der experimentelle Beleg, dass es sich bei einer fraglichen Sequenz um ein exprimiertes Gen handelt, erfolgt durch die Identifizierung der dazu passenden mRNA.
• 3.2) cDNA , EST cDNA >mit Hilfe einer Reversen Transkriptase. Rnase H und DNA-Polymerase aus mRNA hergestellte copy-DNA EST >expressed sequence tag, Teilsequenz einer cDNA
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• 5.)RNA-Seq Altarnative zu Microarrays cDNA aus mRna wird sequenziert  vieles kan damit sequenziert werden
• 5.1.)Das Prinzip der RNA-Seq RNA wird zu cDNA konvertiert und anschließend fragmentiert. Die Sequenzierung der Fragmente „reads“, werden generiert mit dem Referenzgenom (oder Transkriptom) verglichen Anzahl der reads pro Gen gibt Auskunft über die Expressionsstärke
• 6.)Wie wird die Expression einzelner oder vieler Gene bestimmt? Analyse einzelner oder weniger Gene- Northern blot-Analyse (RNA Blotanalyse)- Real time quantitative RT-PCR- Promoter-Reportergenfusionen- In situ-HybridisierungGenomweite Transkriptanalysen (Trancriptomics)- Microarrayanalyse- RNA-Seq- In silico Analyse
• 7.) Northern blot-Analyse (RNA gel blot analysis) Schematische Darstellung einer Northern blot-Analyse. RNA wird isoliert, durch Agarosegelelektrophorese getrennt, auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer markierten komplementären DNA-Probe hybridisiert. Die Markierung der DNA kann radioaktiv ( P) oder nichtradioaktiv(Digoxygenin) erfolgen. Typisches Autoradiogramm als Ergebnis einer Northern blot-Analyse. Die Quantifizierung der Signalstärke kann mit Hilfe eines Phosphoimagers erfolgen. rRNA wird in der Abbildung als Ladekontrolle gezeigt. Northern blot-Analysen galten lange Zeit als Standard. Nachteile: Nachweis nur einzelner oder weniger Gene, große Mengen RNA erforderlich, Ergebnis meist nur semiquantitativ.>Heute meist durch ´Real Time quantitative Reverse Transcription PCR´ (qPCR, realtime PCR) ersetzt.
• 8.)Reportergene in der Pflanzengenetik Meist wird eines der drei folgenden Reportergene benutzt:ß-Glucuronidase (uidA, GUS)einfach zu benutzen, preiswert, histochemischer und quantitativer fluorimetrischerTest möglich, meist genutztes ReportergenGreen fluorescent protein (GFP) und Varianten mit anderen Emissionswellenlängenhäufig in der Zellbiologie zur Bestimmung der subzellulären Lokalisation genutzt;für Entwicklungsbiologen ein wichtiges Markergen für Zellen und Gewebe Luciferasegen (LUC)Vorteil: kann nicht-invasiv ohne Zerstörung von Gewebe genutzt werden; aber:geringe Sensitivität, geringe räumlich Auflösung der Expressionsmuster; meist fürzeitliche Auflösung der Expression und genetische Screens genutzt
• 8.1.)Fluoreszierende Proteine als Reporter Das GFP Gen wurde ursprünglich aus der Quallenart Aequora victoria isoliert. Das 24 kDa große Protein wird mit Blaulicht (395 nm) angeregt, das Maximum der Emission liegt bei 509 nm. Mittlerweile existieren viele Farbvarianten. GFP ist besonders geeignet für die Analyse der Genexpression in der Wurzel  und der subzellulären Lokalisation von GFP Fusionsproteinen.
• 8.2)Das Luciferasegen als Reporter In der Natur kommt die Luciferin-Luciferasereaktion zur Erzeugung von Biolumineszenz in den Peroxisomen eines spezialisierten Lichtorgans von Leuchtkäfern (Photinus pyralis)vor. Die Luciferasereaktion benötigt das Substrat Luciferin und die Kofaktoren ATP, O2 und Mg2+, sie führt zur Emission von gelb-grünem Licht (560 nm). Gekühlte CCD (chargecoupled devise)-Kameras werden zur Detektion der Aktivität in planta benötigt
• 9)mRNA in situ Hybridisierung Bei der in situ-Hybridisierung werden mRNAs genspezifisch in Gewebeschnitten mittels markierten DNA-Sonden detektiert. Die Bilder zeigen die in situ-Detektion eines Gens in einem Embryo mit Hilfe einer Digoxigenin (DIG)-markierten Probe. Digoxigenin selbst wird wiederum mit einem Antikörper detektiert, der an ein Enzym gekoppelt ist (Alkaline Phosphatase oder Peroxidase), das aus chromogenen Substraten ein blaues oder braunes Präzipitat bildet. Das Präzipitat markiert des Ort der Genexpression. Die mRNA des Gens CLV3 wurde mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde hybridisiert und davon ein Autoradiogramm angefertigt (Falschfarbendarstellung). In situ Hybridisierung liefert sehr spezifische Information über dieGenexpression, ist allerdings zeit- und arbeitsaufwendig.
• 9.1.In silico Analyse der Genexpression Für die Analyse der Genexpression in silico sind verschiedene Webtools verfügbar. Z.B. Genevestigator Mit Hilfe von Genevestigator können rasch verfügbare Expressionsdaten für jedes Gen zusammengestellt werden. Welche Gene werden in welchemGewebe, in welchem Entwicklungsstadium oder in Antwort auf bestimmteStressreize (z.B. Kälte, Wärme, Licht, Nährstoffmangel usw.) exprimiert?

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