Bioinformatics1 (Fach) / 2.Vorlesung (Lektion)
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3.Semester
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- Geschichte der DNA -1870 Friedrich Miescher entdeckt DNA -1944 Oswald Avery weist nach, dass DNA genetisches Material ist -1953 James Watson und Francis Crick entdecken die Struktur der DNA
- Der Beginn der Sequenzierung -1964 Robert Holley beendet eine Nukteotidsequenz mit 77 Nucleotiden von der tRNA einer Hefe -1968 Ray Wu und Dale Keiser sequenzieren 12 Basen !! von einem geschlossenen 5´-Ende einer Phage durch die Benutzung von Kettentermination und Polyacrylamidgel-Elektrophorese
- Anfangsphase der Sequenzierung -1977 Allan Maxam und Walter Gilbert entwickeln eine DNA-Sequenziermethode durch chemischen Abbau -1977 Fred Sanger entwickelt die 3´-Dideoxykettenterminationsmethode
- chemische Abbausequenzierung 1. DNA-Doppelstrang wird bei 90°C gespalten und auf Agarosegel in einer Elektrophorese auf getragen. 2.einer der Stränge wird genommen und der zu sequenzierende Teil wird herausgeschnitten und vervielfählitigt. 3.die Kopien werden mit Dimethylsulfat versetzt, das sich an die G´s in der DNA setzt. 4.Piperidine (Restriktionsenzyme) schneiden nach jedem mit Dimethylsulfat versehenen G. -> es entstehen unterschiedlich lange Fragmente. 5.Dies wird mit allen Basen wiederholt und anschließend wird eine Polyacrylamidgelelektrophorese gemacht. 6. nun können die Fragmente sortiert werden und ein Längenunterschied von einer Base ist sichtbar -> DNA-Sequenz kann abgelesen werden
- Kettenabbruchmethode zum DNA-Sequenzierung 1.)gewünschte Sequenz vervielfähltigen und mit Primer versehen 2.) Desoxynucleotid wird hinzugegeben (pro Versuch nur eine Sorte) 3.) Sequenzen werden normal komplimentär ergenzt bis ein Desoxynucleotid eingebaut wird -> mit allen 4 Desoxynucleotiden nacheinander durchführen 4.) Gelelektrophorese sortiert Sequenzstücke und die genaue Sequenz ist ablesbar
- Heutiges Sequenzieren -1983 Marvin Carruthers entdeckt eine Methode um DNA-Fragmente zu bauen mit einer festgelegten Sequenzlänge von 5 bis 75 Basenpaaren. Er und Leroy Hood entwickeln ein Instrument, das diese Fragmente automatisch macht. -1983 Kary Mullis entwickelt die Methode für die Polymerasekettenreaktion (PCR) -1987 ABI370 ist die erste vollautomatische Sequenziermaschine -1995 Craig Venter benutzt die Shotgun-Sequenzingmethodentechnik zum bestimmen von mehreren Genomen des Bakterium Haemophilus influenzae -2005 Vorstellung der Sequenzingmachine GS20: erster Schritt in nächsten Generation des Sequenzieren
- Zusatz zum heutigen Sequenzieren Desoxynucleotide mit verschiedenen fluoresierenden Stoffen zum besseren Ablesen der Sequenzreihenfolge durch einen Detektor -ABI-Sequenziermaschine produziert ein farbiges Chromatogramm von der DNA-Sequenz -verschiedene Primer für Kettenabbruchsreaktionzum Sequenzieren: -> universal Primer kann sich am Anfang des Gens anlagern: Sequenzierung ganzer Gene -> interner Primer kann sich innerhalb des Gens anlagern: Sequenzierung von Genfragmenten -PCR mit einem Primer und einer der vier Desoxynucleotide, die zu einem Kettenabbruch führen -> Wiederholung mit allen Desoxynucleotiden und anschließender Gelelektrophorese zur Seperierung
- Sequenzieren der nächsten Generation -massive Parallelisierung des Sequenzierungsprozess -relativ kurze Lesedauer -verschiedene Herangehensweisen durch die Verbesserung von Sangers Technik zur direkten Observation von DNA durch ein Mikroskop -Versuch ein einzelnes Molekül zu sequenzieren ohne einen Vervielfähltigungsschritt
- NGS: Pyrosequenzierung 1.Synthese eines DNA-Gegenstranges durch die Sanger-Sequenzierung mit einer DNA-Polymerase 2.die DNA-Mischung wird mit einem DNA-Adapter ligiert und über eine komplementäre Adaptersequenz an beads gekoppelt. 3.die mit DNA beladenen beads werden auf eine Platte mit Poren von der Größe eines beads gegeben, bei der unter jeder Pore ein Lichtleiter zu einem Detektor führt. 4.die DNA-Polymerase wird gewissermaßen „in Aktion” beobachtet, wie sie nacheinander einzelne Nukleotide an einen neusynthetisierten DNA-Strang anhängt. Der erfolgreiche Einbau eines Nukleotids wird durch ein ausgeklügeltes Enzymsystem unter Beteiligung einer Luziferase in einen Lichtblitz umgesetzt und von einem Detektor erfasst. Die zu sequenzierende DNA dient als Matrizenstrang und liegt einzelsträngig vor. Ausgehend von einem Primer erfolgt die Strangverlängerung, Nukleotid um Nukleotid, durch Zugabe von jeweils einer der vier Arten der Desoxynukleosidtriphosphate (dNTP). Bei Zugabe des passenden (komplementären) Nukleotids erhält man ein Signal, wurde ein an dieser Stelle nicht passendes NTP zugegeben, bleibt der Lichtblitz aus. Danach werden die vorhandenen NTP zerstört, und eine andere Art wird zugesetzt; dies wird fortgesetzt, bis sich wieder eine Reaktion zeigt; spätestens nach der vierten Zugabe zeigt sich eine Reaktion, da dann alle Arten von NTP durchprobiert wurden.
- NGS: Illumina 1. Herstellung von Amplikons mit PCR 2. Reperation der Enden und hinzufügen eines Überhangs 3. Hinzufügen des Bindungsadapters und auswählen der DNA 4. Anhängen der DNA an eine Durchflusszelle und Bildung der Brückenamplifikation 5. Sequennzieren und ablesen der Basen
- NGS: Ion Torrent Allgemeine Daten -10mal schneller als andere NGS -Sequenzingdurchgang läuft 2 Stunden, weil zeitdeckende Wahrnehmung der Sequenzergänzung -Stapelpräperation führt zu 6 Durchgängen in 6 Stunden -Fähig zu 6 Proben pro Tag auf 2 PGM-Systemen
- NGS: Ion Torrent Vorkehrungen um Sequenzierfehler zu vermeiden -modifizierte Basen -fluoresierende Basen -Laserabfrage -enzymatische Amplifikationskaskade
- NGS: Ion Torrent Maßnahmen die zur Leselängebeschränkungen führen -unnatürliche Bases -falsche Synthes -langsame Zykluszeit
- NGS: Ion Torrent Erklärung der direkten Detektion -Nucleotide fließen beim komplemetären Ergenzen über einen Inonensemikonduktorchip -> wird ein Nucleotid ergänzt wird ein H+ abgespalten, das der Sensor regestriert. -ein Sender pro Einbuchtung und pro Sequenzingreaktion -direkte Registrierung von der natürlichen DNA-Verlängerung -Millionen von Sequenzierreaktionen pro Chip möglich -schnelle Ziykluszeit und Echtzeit Erkennung
- Sequenzierung der dritten Generation Pacbio RS Sequenziert einzelne Moleküle: Pacbio RS by Pacific Biosience -vier verschiedene flourosierende Farbstoffe sind gleichzeitig präsent - 2-3 Nucleotide pro Sekunde -2-3 Kb (bis zun 50) Leselänge -6TB Daten in 30 Minuten
- TGS: MinION -Sequenziert einzelne Moleküle: MinION von Oxford Nanopore -> DNA kann sequenziert werden beim durchfädeln durch eine mikroskopische Pore einer Membran. Die Basen werden identifiziert durch die Art und Weise wie sie das Ionenfließverhalten durch die Pore von der einen zur anderen Seite beeiflussen. Schritt1: Ein Protein trennt die DNA-Doppelhelix in zwei Einzelschritte Schritt2: Ein zweites Protein macht in die Membran eine Pore und hält ein Adaptor-Molekül Schritt3: Ein Fluss von Ionen durch die Pore erzeugt einen Strom. Jede Base beeinflusst den Strom um einen anderen Grad . Schritt4: Das Adapter-Molekül hält die Base lang genug an einem Ort fest, bis sie elektronisch identifiziert werden kann.
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- Elektronenübertragungsmikroskopie Schritt1: Denaturierung der DNA Schritt2: Kennzeichnung mit schweren Atomen Schritt3: Ausrichtung der DNA auf Substrat Schritt4:Bildgebung durch Elektronenübertragungsmikroskop
- Sequenzieren von Informationen : zwei Ansätze - Clone contig Ansatz: Position der Sequenz bereits bekannt - Whole-Genom Shotgun Ansatz: Marker werden benutzt um Auftauchen der Sequenz in der DNA zu finden
- Sequenzmontage Ein fundamentales Ziel der DNA-Sequenzierung ist es große zusammenhängende Regionen der DNA zu generieren. -Kapillarsequenzierung kann ungefähr 600 bis 800 Basenpaare lesen. -> Überlappung basieren auf Montagealgorithmen (phrap, phusion, arachne) -> errechnen aller Überlappungen des Ablesens und anschließend lösen der Überlappung um die Montage zu generieren. -Im Prinzip ist das montieren einer Sequenz einfach die Aufgabe Überlappungen zu finden und zu kombonieren -praktisch: die meisten Genome enthalten viele Kopien von Sequenzen; es gibt viele Mutationen (natürlich auftrettende Zell-zu-Zell Variationen oder generierte durch PCR oder klonen); es gibt Sequenzierfehler
- Montageprobleme Teile überlappen sich aus Zufall -> inkorekte Überlappung Sequenzierungslücken-> Teile des Genoms sind nicht ermittelt Schließungslücken -> bei Plasmiden; Verbindungen fehlen
- Montage von Sequenzen im Falle von NGS -Volumen und Leselänge von Daten, die von NGS-Maschinen hergestellt werden, bedeuten, dass zentralistische Leseüberlappungsansätze nicht mehr möglich sind -> 1980 Pevzner: Vorstellung einer alternativen Montagerahmen basierend auf dem de Bruijn-Graphen -> basieren auf der Idee von einem Graphen mit Subsequenzen festgelegter Länge (kmers) -> Schlüssel ist nicht die Speicherung von Lesesequenzen - nur K-Mer Füllinformationen in der Graphstruktur
- De Bruijn Konstruktion Genome werden abgetastet mit zufälligen Sequenzen zum Beispiel mit 7 Basenlängen; Errors werden in rot dargestellt. Wenn eine Sequenz nicht ganz passt. Die k-mers (Bsp. 6-mers) sind in Knoten angeordnet und die Übereinstimmung von jeden Knoten wird mit Nummern über den Knoten notiert. Features: kontinuierliche lineare Abschnitte innerhalb des Graphen; Sequenzierungsfehler sind klein frequentierte Gipfel in dem Graph ->Vereinfachund von linearen Abschnitten -> Errorentfernung
- Wiederholungsprobleme - sehr ähnliche Sequenzen können falsch montiert werden, besonders wenn die wiederholende Region länger ist als die durchschnittliche Leselänge, bei Tandemduplikationen und Umsetzung von mobilen Elementen.
- nächste Genmontage - erster auf de Bruijn basierender Monteur wurde von 454 Life sience entwickelt um große Fehlerquellen in den Griff zu kriegen -viele weitere de Bruijn Monteure wurden entwickelt: die meisten benutzen Kumpel-Paar Informationen -leicht anderer Ansatz für die Transkriptomemontage: es muss erlauben, dass viele diskontinuierliche Graphen eine einzige Transkription darstellen, auch paraloge und altenativ geschnittene.