Pflanzenzüchtung (Fach) / Technik (Lektion)

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• Analyse von Nukleinsäuren: 1. Isolation: 2. Amplifikation: 3. Transformation: DNA Übertragung in eine lebende Zelle 4. Analyse:
• Amplifikation geziehlte Vermehrung der DNA-Abschnitte
• DNA Wasserstoffbrückenbindungen Wie viele werden bei den Aminosäuren ausgebildet,die die DNA bilden? Thymin und Adenin bilden 2 Wasserstoffbrückenbindungen aus Cystein und Guanin bilden 3 Wasserstoffbrückenbindungen aus
• Stabilität von DNA Kennt man die eine Hälfte der DNA, so kennt man auch die andere Hälfte Bei hoher Temperatur werden die Wasserstoffbrückenbindungen aufgelöst und die Stränge getrennt Bei einer Abkühlung werden wieder Wasserstoffbrückenbindungen gebildet So kann man die DNA eines Menschen und des Chimpansenverbinden und herausfinden wie ähnlich sie ist. Doch es kann zu mismatch kommen, da einige einzelne Moleküle keine Verbindung eingehen können
• Agarose-Gelelektrophorese Auftrennung von Molekülen in einem elektrischem Feld Bei Spannung wandert die DNA zur Anode, da sie negativ geladen sind Da die kürzeren DNA sich schneller bewegen, sind diese näher an der Anode, als die größeren. So kann man die DNA nach Größe sortieren
• Die DNA-Polymerisatio läuft immer in 5' → 3' Richtung Das Enzym Polymerase verlängert ein exisitierenden Strang Dazu braucht das Enzym ein kurzes doppelstrangiges Stück Fehler können Krebs oder Erbfehler hervorrufen, geschieht aber nur ser selten arbeitet bei ca. 37°C
• Amplifikation von DNA aus lebenden oder abgestorbenen Gewebe DNA wird hoch vermehrt x Ausgangsmoleküle / theoretische Anzahl an Molekülen nach n-Zyklus = 2n Da Polymerase bei hohen Temperaturen nicht arbeitet, wurden von Lebewesen, die in Gewässer mit hohen Temperatur leben, die Polymerase gewonnen Dieser erster Organismus der Polymerase nennt sich TAQ Das Gerät Thermocycler erhitzt und kühlt sehr schnell
• Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion künstliches Verfahren zur Vervielfältigung von DNA Im Thermocycler wird die DNA mit freien Nukleotiden, DNA-Polymerasen und speziellen Primern zusammengebracht Es sind mehrere Zyklen notwendig, bis genügend DNA vervielfältigt wurde Pro Zyklus steigt die Zahl der DNA-Doppelstränge exponentiell ca. 30-50 Zyklen Denautierung: DNA wird auf ca. 90°C erhitzt → Wasserstoffbrückenbindungen lösen sich auf Hybridisierung: Bei ca. 60°C lagern sich die Primer an die 3' Enden der DNA Einzelstränge an. Polymerisation: Bei 70°C beginnen die Polymerasen an den Primern von 3' nach 5' mit der Anlagerung von komplementären Basen
• DNA - Ligation DNA-Ligasen ist ein Enzym, das Strangbrüche in der DNA repariert. Katalysieren die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen der 3'-Hydroxylgruppe des einen und der 5'-Phosphatgruppe des anderen DNA-Fragments.
• Maßeinheit der DNA 1 Basenpaar = 1bp 1000bp = 103bp = 1Kbp 1.000.000bp = 106bp = 100Kbp = 1Mbp 1.000.000.000bp = 109bp = 1000Mbp = 1Gbp 10 Mbp = 3,28 mm
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• Sanger Sequenzierung Kettenabbruchsynthese nach Sanger Methode beruht auf einer enzymatischen Reaktion Das DNA-Molekül wird zunächst durch Hitze in die zwei Einzelstränge gespalten Ausgehend von einem kurzen Abschnitt bekannter Sequenz, dem sogenannten Primer, der sich an einen Einzelstrang anlagert und so ein kurzes Stück Doppelstrang bildet, verlänergt das Enzym DNA-Polymerase den fehlenden der beiden komplementären DNA-Stränge In vier sonst gleichen Ansätzen wird je eine der vier Basen zum Teil als Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP) zugegeben. DdNTP besitzen keine 3'-Hydroxylgruppe, die für die Verknüpfung it dem nächsten Nukleotid notwendig ist Es komt zu eine Kettenabbruch und es entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge Nach der Sequenzierung werden alle Fragmente mittels Gelelektrophorese aufgetrennt
• Prinzip der Illumina-Sequenzierung basiert auf eine Anheftung zufällig fragmentierter, genomischer DNA-Stücke an eine planare, optische Oberfläche (Flow Cell) und einer anschließenden Festphasen-PCR. Adapter bestehen aus Primern für die Amplifikation und aus Sequenzen Die Länge der Fragmente bestimmt die Größe der Cluster, die bei der Amplifikation entstehen. Je kleiner, desto besser, weil dann mehr Cluster auf der Flow Cell Platz finden und mehr Sequenzen generiert werden Die DNA-Stücke werden im ersten Schritt in derFlow Cell mittels Hybridisierung der komplementären Sequenzen eingefangen Im Zweiten Schritt wird ein Antiparalleler Strang des zu sequenzierenden DNA-Moleküls synthetisiert. Es entstehen Millionen Reaktionen
• vereinfachte Darstellung eines Plasmidvektors Plasmid: zirkuläres DNA-Molekül zusätzlich zu Bakterienchromosom in der Bakterienzelle Bestandteil bakterieller Genome Resistenzmarker AmpR = Resitenzgen für Antibiotika → Amplizin = dait sieht man, ob die Transformation stattgefunden hat ori = Beginnt die Vermehrung, Polymerase dockt dort an lacZ' und lacl = Reportergen = berichtet ob das Gen enthalten ist → Färbung des Bakteriens → Blaufärbung Klonierungsstelle = wo die fremde DNA rein kommt Plasmid wird geschnitten, sodass links und rechst die Klonierungstellen sind 
• Plasmidklonierung Plasmid wrird mit Hilfe von Resttriktionsenzymen versetzt geschnitten, so das überhängende Enden entstehen Die Ziel-DNA soll als Inserat in den Vektor integriert werden und wird mit den gleichen Enzymen geschnitten, sodass komplementäre Enden an Vektor- und Ziel-DNA entstehen Die kompatiblen, überhängenden Enden finden zueinander und hybridisieren miteinander. Sie ligieren und es entsteht ein rekombinantes Plasmid. Abschnitte in Blau und farblos werden unterschieden Die Bakterien werden mit dem Antibiotika Amplizin versetzt → Nur die Bakterien, die das AmpR haben,können wachsen und haben die fremde DNA aufgenommen. Die die dieses nicht haben sterben ab, da sie nicht resistenz gegen das Antibiotika sind 
• cDNA  ein einzelsträngiges DNA-Molekül, dessen Basensequenz sich zur Sequenz eines RNA-Moleküle komplementär verhält
• cDNA-Klonierung Klonierungsverfahren, bei dem zunächst gereinigte mRNA in DNA umschreibt und diese dann in einem Klonierungsvektor einbaut → Vermehrung von RNA
• cDNA-Klonierung / Synthese Ausgangsmaterial ist eukaryotische MessengerRNA. Sie hat am 3' Ende eine lange Abfolge von Adenosin (Poly-A-tail) Säulenchromatografie = Die Säule ist nur mit T beschichtet (einzelsträngige T-DNA) und somit kann sie sich an das 3' Ende der MessengerRNA mit Wasserstoffbrückenbindungen verbinden 1. Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase kann aus RNA die dazu komplementäre cDNA hergestellt werden. 2. Die spezifische DNA-abhängige DNA-Polymerase benötigt einen Primer zur Synthese, welcher an die RNA bindet. 3. Meist wird als Primer ein Oligo-dT-Nukleotid (MessengerRNA) 4. Das Produkt ist nun ein cDNA-Strang, der mit dem ursprünglichen RNA-Strang hybridisiert ist. 5. RNA kannn nun mittels einem Enzym RNase H abgebaut werden. 6. In der weiteren Prozessierung wird nun mittels einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase der komplementäre DNA-Strang zum schon bestehenden cDNA-Einzelstrang synthetisiert. 7. Als Primer können dabie mRNA Reste dienen, die noch nicht von der Rnase H abgebaut wurden. 8. Das Ergebnis ist ein doppelsträngige cDNA. 
• Glyphosattoleranz – gezielte Veränderung von Nutzpflanzen Gene werden gezielt in Pflanzenzellen eingeschlossen Spendergen wird in einem Vektor kloniert und wird in das Bakterium Argobacterium tumefaciens transformiert. Sie sind in der Lage die DNA in die Pflanze zu bringen Pflanze hat Abwehrstoffe gegenüber fremder DNA, die Nukleasen Es gibt auch eine vektorfreie Transformation
• Erzeugung von Wurzelgallen Plasmid hat eine bestimmte Regien, die T-Region → T-Region wird mobilisiert und in eine Empfängerzelle, also ein einzelsträngiges DNA an die Pflanze abgegeben → Dies führt zu einem Phänotyp → Wurzelgallen Bakterium verfügt über pflanzliche Gene → Plasmid hat grün Auxine Cytogenese → Pflanzenhormone die eine Zellteilung bewirken und es entstehen Wucherungen Pflanze produziert Opine, die dem Bakterien als Nahrungsquelle dienen
• Regeneration und Selektion Argobacterium werden nur wenige Zellen infiziert Es werden Kallus gebildet Es wird ein Antibiotika eingesetzte und alle sterben, die nicht das Resitenzgen haben Sproßinduktion = Wachstum und Sprossen der Wurzeln durch Hormone
• Gezielte Modifikation mit Designer Endonukleasen dient zur gentechnische Veränderung Endonukleasen schneidet DNA Dann lässt man die DNA heilen → Die Zelle macht es selber → DNA ist so wie sie früher war → Aber es gibt Unregelmäßigkeiten → Basen fehlen Man kann mit der Designer Endonukleasen gezielt Gene ausschalten    

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