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Molekulargenetik (Fach) / Epigenetik (Lektion)

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• Definition 2 wichtige Mechanismen + Beispiel Chromatin Definition: epi = auf, erbliche Phänomene welche nicht in der DNA-Sequenz selbst codiert sind (→ A, G, C, T ist nicht alles) → 2 Zellen haben also gleiches Genom, aber nicht gleiche Epigenome 2 Mechanismen: 1. DNA-Methylierung 2. Histon-Modifikationen: Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung,... Beispiel: Histon H3: Acetylierung an Lys 4, 9,... → Lys ist basisch/hat + Ladung → verschwindet wenn acetyliert Chromatin: 1 Histon = 8 Untereinheiten (2x H1, H2, H3, H4) → bilden Perlenkette, rollen sich auf und bilden Schlaufen um Proteingerüst = Scattfold → so sieht DNA in Interphase aus Untereinheiten haben flexible (offen endene) Amino-Termini → leicht zugänglich für Modifikationen Histone haben viele + Ladungen, DNA hat viele - Ladungen → binden gerne zusammen
• Regulation der Transkription über Chromatinstruktur Transcriptional activation/repression Transcriptional activation: bei DNA hypomethylierung und Histon hyperacetylierung → führt dazu, dass weniger Ladung auf Histonen → binden weniger gut DNA → diese geht auf und RNA-Polymerase hat platzt zum Binden Transcriptional repression: bei DNA hypermethylierung und Histon hypoacetylierung → DNA geschlossen → keine/weniger Transkription
• Imprinting Definition Mechanismus Beweis Anzahl Gene + Beispiel einige Gene werden nur vom maternalen oder paternalen Allel exprimiert → allelspezifische Expression durch genomisches Imprinting molekularer Mechanismus: Methylierung von Cytosin in CpG-Dinukleotiden (CpG = G nach C, CG = Basenpaar) → d.h. Methylierung nur möglich wenn nach C ein Guanin kommt → paternales und maternales Genom nicht equivalent (Epigenome unterschiedlich) Beweis: uniparental diploide Embryone → 2 weibliche Genome (Gynogenote) → relativ normaler Embryo, aber schwere extrabembryonale Defekte (keine Plazenta gebildet); 2 männliche Genome (Androgenote) → schwere embryonale Defekte, aber relativ normale extraembryonale Strukturen (= Mole) Anzahl Gene mit Imprinting: 50-200 (= 1%) Beispiel: XIST → auf x-Chr. → codiert für RNA (nicht für Protein), 1 x-Chr. des Weibchen ist inaktiv, nur XIST wird transkribiert → inaktivert x.Chr
• Methylierung von Cytosin Islands Folge Mutation Islands: CG liegt in Säugergenom normalerweise methyliert vor (5-Methylcytosin), dieses mutiert aber sehr häufig zu TG oder CA → CG fast nur noch in CpG-Islands weil dort Methylierung aktiv unterdrückt wird → CG bleibt stabil Folge: wenn methyliert → exprimiert → CpG-Islands werden weniger exprimiert Mutation: Cytosin mutiert spontan zu Uracil → wird als fremd erkannt und repariert; 5-Methylcytosin mutiert zu Thymin → wird nicht erkannt → bleibt instabil
• Löschen der Imprints in Keimbahn Zeitpunkt Erklärung Zeitpunkt: während Oocytenreifung in der weiblichen Keimbahn, vor der Meiose in den männlichen Keibahn Erkärung: Y-Spermium (wird also Männchen geben) mit Imprint auf Alle B, Eizelle mit Imprint auf Alle A → kommen zusammen → in Eizelle wird Imprint von A auf B gewechselt dito für wenn X-Spermium
• Imprinting und Chromatinstruktur im Nukleus anhand dem Mauslokus Igf2 Beispiel am Schwein maternales Allel: unmetyhliert, pateranles Allel: methyliert auf dem gleichen DNA-Abschnitt befinden sich DMR (differntialy methylated region) → diese lagern sich beim Weibchen (unmethyliert) so aneinander an (durch Proteine), dass das Igf2-Gen in das stille Kompartiment (im Kern, Bereich mit wenig Transkription) gedrückt wird beim Männchen werden sie aber anders aneinandergelagert und drücken so das Igf2-Gen in das aktive Kompartiment → wird exprimiert Beispiel am Schwein: Imprinting auf SSC2q (nur parenterales Alle wird exprimiert) → G>A Substitution im Intron 3 des Igf2-Gens für Insulin-like growth factor → führt dazu, dass Bindestelle für reprimierenden Transkriptionsfaktor zerstört wrid → mehr exprimiert → Tiere mit paternalem A-Allel haben postnatal höhere Igf2-Expression im Skelettmuskel (mehr Muskelmasse)
• Callipyge beim Schaf Definition Erbganganalyse Dominanzeffekt Beweisversuche Mutation Beweis Definition: Callipyge = schönes Hintern, d.h. muskuläre Hypertrophy (hauptsächlich schnelle Muskelfasern) Erbganganalyse: CLPG-Männchen + Wildtyp-Weibchen → 50% CLPG Nachkommen → sieht nach monogen autosomal dominant aus Wildtyp-Männchen + CLPG-Weibchen → 0% CLPG CLPG-Männchen + CLPG-Weibchen → nur 25% CLPG → nur Hypertrophie wenn CLPGpat/+mat Dominanzeffekt: normalerweise liegt Heterozygote zwischen den beiden Homozygoten, liegt er etwas oberhalb → Dominanzeffekt, hier aber Überdominanz n Abhängigkeit von Herkunft des mutierten Allels = polare Überdominanz (gibts bis jetzt nur bei Callipyge) Beweisversuche: 1. Kopplungsanalyse + Sequenzierung des Kandidatenintervalls: zahlreiche Sequenzunterschiede → konnte nicht gesagt werden wo Mutation liegt 2. Vater von Solid Gold ist auch Vorfahre von Solid Gold's Enkel → Enkel hat Genom ohne Zielmutation und hat Rekombination im Chr. 18 → Enkel (ist kein Callipyge) hat fast komplette Übereinstimmung mit Solid Cold in Rekombinationszone → ausser Ort der Mutation → im homozygoten Bereich sollte es eine Stelle haben welche heterozygot ist wegen der Mutation → es muss nur 1 Schaf sequenziert werden Mutation: A/G-Transversion zwischen 2 Genen (Einzelbasenaustausch) Beweis: AvaII spaltet vor A (im Wildtyp), G wird im CPLG nicht erkannt → nicht gespalten → andere Banden nach Elekrophorese → Solid Gold hat ca. 20% G-Allel → Mutation geschah nicht in Keimbahn des Vaters, sondern im 2-8-Zell-Stadium des Embryos
• Entstehung des CLPG-Phänotyps Mutation liegt zwischen DLK-Gen (paternal exprimiert) und GTL-Gen (maternal exprimiert) in muskelspezifischem long-range Kontrollelement DLK codiert für TF für Muskelwachstum, GTL codiert für reprimierende RNA → bremst DLK  +/+ → Effektor still + Repressor still CLPGmat/+ → DLK still + Repressor aktiv (unnötig) CLPGpat/+ → DLK aktiv + Repressor still → postnatale Expression von DLK im Skelettmuskel → Muskelhypertrophie CLPGpat/CLPGmat → DLK aktiv aber auch Repressor aktiv → keine postnatale Expression von DLK im Skelettmuskel → transkriptionelle Inaktivierung über Veränderung der Chromatinstruktur → führt zu funktioneller Änderung
• Analyse von epigenetischen Phänomenen Methylierungsstatus Nachweis des Methylierungsstatus: Cytosin mutiert zu Uracil (verhält sich wie Thymin bei PCR), 5-Methylcytosin mutiert nicht 1. genomische DNA, 2. Bisulfidbehandlung, 3. PCR, 4. Klonierung und Sequenzierung → 10 Klone: 8 mit C, 2 mit T (an gleicher Stelle) → 80% der Materials war methyliert
• Callipyge, zeitlicher Verlauf Wildtyp vs. CLPG früh in embryonaler Entwicklung: kein Unterschied zwischen den beiden Allelen 2 Wochen praenatal: Wildtypallel → kaum RNA mehr übrig, CLPGallel → normal viel RNA 2 Wochen postnatal: auch CLPGallel mit weniger RNA 8 Wochen postnatal: immer noch RNA übrig

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