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Molekulargenetik (Fach) / Genomsequenzierung (Lektion)

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• Mitochondrial DNA (mtDNA) Anzahl Basenpaare + Gene Aufgaben Vererbung Codierung Sequenzierung Anzahl Basenpaare und Gene: ca. 16'000bp, 37 Gene → mtDNA besitzt eigenen genetische Code (d.h. 3 Buchstaben geben AS) Aufgaben: ATP-Gewinnung Vererbung: rein maternal (mt des Spermiums werden nicht Bestandteil von Embryo) Codierung: alle RNAs der mt werden von mtDNA codiert, während meisten Proteine in mt vom Kerngenom codiert werden Sequenzierung: 1. Gewebeprobe (z.B. Leber), 2. Homogenisierung im Mixer (Saccharose-Puffer), 3. Aufreinigung der mt durch Zentrifugation, 4. Lyse, Isolierung der DNA, Trennung zirkulärer/linearer DNA (mtDNA sind zirkulär, Kerngene sind linear), Chromatographie, 5. Präzipation der reinen mtDNA
• Sequenzierung des Kerngenoms 2 Strategien + Eigenschaften clone by clone: sehr genau, langwierig, teuer whole genom shotgun: höheres Risiko von Assembly-Fehlern, schnell, kostengünstig + hybrid strategy = Kombination der beiden Strategien
• Clone by clone Fragmente Vektor + Insert BAC Contig Sequenzierung eines Klons Zusammensetzen Finishing Vektor + Insert: Vektor = E. coli-Plasmid an 13'000bp + Restritkionsenzym → schneidet 1'000bp raus → Platz für Insert (via Ligase + Transformation in Bak) Insert = 200'000bp welche durch wenig (damit nicht zu oft geschnitten damit grössere Fragmente entstehen) Restriktionsenzyme entstehen → Vermehrung von 200'000ender Fragmente im BAC = bacterial artificial chromosome (Plasmid kann nur 10'000er Fragmente vermehren) BAC: lebt auf Saccharose-Boden, hat Chloramphenicol-Resistenz hat SacB: produziert toxisches Produkt in Gegenwart von Saccharose, aber hier nicht weil high copy origin of replication dazwischen → nur wenn etwas schief geht wird Toxin produziert (Kontrollsystem) hat high copy origin of replication: heisst, dass es viele Kopien davon hat → soll also viel von etwas produzieren → teilt sich schneller → kann so aber instabil werden hat auch single copy origin: kann auch 2 Kopien haben weil kurz vor Zellteilung Genom verdoppelt Contig: Isolierung von BAC-DNA → Spaltung mit Restriktionsenzym → Gelelektrophorese → Banden → Contig = räumliche Anordnung der Klone da wenn ähnliche Banden (überlappende Bereiche) → sind nahe zusammen auf einem Chromosom Sequenzierung eines Klons: mechanisches Scheren der DNA → Grössenselektion via Elekrophorese → Reparieren der Enden → Ligantion in Plasmidvektor + Transformation in E.coli → Sequenzierung von ca. 1000bp  mti je 2 Primerbindungsstellen → also immer von rechts und links Zusammensetzen: der Gesamtsequenz am Computer = Assembly Finishing: gezieltes Sequenzieren von Lücken und unsicheren Stellen (teuer)
• Assembly Vorgehen 1. Erzeugung der Sequenzen auf automatische Sequenziergeräten 2. base calling: Basen + Qualitätswerte werden aus Rohdaten ermittelt 3. vektor und Qualitättrimming: Entfernen von Vektorsequenzen und Sequenzen schlechter Qualität 4. Entfernen von E.coli Sequenzen 5. optional: Maskierung repetitiver Sequenzen → werden durch N ersetzt 6. vollautomatisches Zusammensetzen der Einzelsequenzen in Contigs (hohe Stringenz) 7. Entfernen der Maskierungen von Repeats 8. halbautomatisches Zusammensetzen von grösseren Contigs (reduzierte Stringenz) 9. Finishing, Einbau von gezielt erzeugten Sequenzen, Schliessen von Lücken und unsicheren Stellen
• whole genom shotgun Vorgehen Säugergenom → shotgun library → 30 Mio Einzelsequenzen → Zusammensezten der Sequenz → Problem: Assembly im Bereich repetitiver Sequenzen, Unterschiede zwischen den beiden Allelen → Überlappung kann nicht eindeutig zugeordnet werden Lösung: Ausnützen der Read-Pair Information (von links und rechts abgelesen) → Abstand = Insertgrösse des Plasmidklons → Insert sollte grösser sein als grösste repetitive Sequenz anschliessend wieder Formen von Contigs und Supercontigs, wenn 2 Supercontigs zusammengehören → zusammengesetzt mit N → zwar bp nicht bekannt aber dafür durchgehende Sequenzen anschliessend können bestimmte Marker auf bp den Chromosomen zugeordnet werden → und so auch die Contigs den Chromosomen → ergibt Draf-Sequenzen = Rohfassung
• modernere Verfahren Vorteile und Nachteile + enorme Durchsatzsteigerung + wesentlich kostengünstiger - kürzere Leseweite (nur 200bp) - Assemblierung schwierig

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