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biogene am (Fach) / Teil 7 (Lektion)
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- Gründe für die Isolierung von Pflanzenstoffen • Pflanze = billigste Quelle für zahlreiche Arzneistoffe• Ausarbeitung analytischer Methoden für die Qualitätskontrolle von Arzneipflanzen und Phytopharmaka• Bestimmung des Wirkprinzips von Arzneipflanzen
- Pflanze als Produzent von Leitsubstanzen in der Medizin – Steroidsaponine -> Corticoide– Vinblastin -> Vincristin– Morphin -> Codein– Shikimisäure -> Oseltamivir – Mutterkornalkaloide -> LSD– Morphin -> Heroin
- Faktoren, die das Inhaltsstoffmuster beeinflussen • Chemotypen– Teebaum: • Cineol- und Terpinen-4-ol-Typen – Maiglöckchen: unterschiedliche Rassen in Ost- und Westeuropa - Convallatoxin • Kultur- oder Wildpflanze• Klimatische Einflüsse– Regen: Auswaschen polarer Inhaltsstoffe– Lichteinstrahlung: je mehr Sonne, umso mehr Flavonoide– Höhenlage • Düngung:viel Stickstoff für Alkaloidpflanzen• Krankheiten• Erntezeitpunkt– Unterird. Organe: nach Abschluß der Vegetationsperiodeoder vor dem Austreiben– Rinden: wenn erste Entwicklung der oberird. Teile zumStillstand kommt, kurz vor der Blüte– Blätter: kurz vor oder während der Blüte– Blüten: kurz nach dem Aufblühen– Früchte, Samen: zur Vollreife • Erntebedingungen • Verwendeter Pflanzenteil z.B.– junge Blätter ungleich ältere Blätter– Stammrinde ungleich Astrinde !! • Schälen• Nachbehandlung • Trocknungsbedingungen– rasch, schonend, unter Durchlüftung– Horden-, Bandtrocknung– Mikrowellen-, Gefriertrocknung • Lagerungsbedingungen– unzerkleinerte Droge– Lichtschutz, Feuchtigkeitsschutz
- Vorgangsweise zur Isolierung unbekannter/bekannter Substanzen • Isolierung unbekannter Substanzen– Herstellung unterschiedlich polarer Auszüge– Testung– Fraktionierung der wirksamen Auszüge– Reindarstellung der Einzelkomponenten– Strukturklärung • Isolierung eines bekannten Wirkstoffes– Ausarbeitung eines Isolierungsprotokolls-> Charakterisierung der isolierten Substanz
- Definition Bioassays Tests, durch welche die biologische Aktivität eines Extraktes oder einer Substanz aus einem lebenden Organismus ermittelt wird.
- Möglichkeiten zur präklinischen Testung • in vitro– chemische Tests– enzymatische Tests– Rezeptorbindungsmodelle– Tests an Zellkulturen– molekularbiologische Methoden• ex vivo– lebende isolierte Organe oder Gewebe• in vivo– am lebenden Organismus
- in vitro Präklinische Testung enzymatische Tests, Rezeptorbindungsmodelle, Tests an Zellkulturen, molekularbiologische Methoden, Genexpressionsstudien,…..– Vorteile: schnellgeringe Substanzmengen nötigWiederholung einfachHinweise auf Wirkungsmechanismus möglich – Nachteile: schlecht auf in vivo Situation umzusetzen Fehlen von in vivo Aktivität möglich, weil anderer Mechanismus relevant oder weil Metabolisierung der im in vitro Test aktiven Substanz erfolgt • oft hohe Standardabweichungen• ev. inkonsistente Ergebnisse durch wenig Problembewusstsein zu Löslichkeit der Testsubstanzen im Modell fehlende Information zur Aufnahme der Testsubstanzen in die Zellen Abbau von Testsubstanzen während der Inkubation • vielfach Reinsubstanzen in sehr hohen Konzentrationen getestet
- ex vivo Präklinische Testung Tests an lebenden isolierten Organen oder Geweben– Vorteile: Situation im Zielorgan erfassbar Reaktion des gesamten Gewebes oder Organs aufSubstanz messbar– Nachteile: Organe müssen präpariert werden nur begrenzt lebensfähig kein Aufschluss über Bioverfügbarkeit oder ob ev. Metabolisierung für Wirkung notwendig
- in vivo Präklinische Testung am lebenden Tier– Vorteile: beste Aussagen bezüglich klinischer Wirksamkeit und toxische Effekte erfassbar– Nachteile: kaum Information über Wirkungsmechanismus Design sehr sorgfältig zu planen hohe Kosten
- Grundsätzliche Anforderungen an Screening-Testsysteme • Zusammenhang mit therapeutischer Wirkung• anwendbar an stark gefärbte, oft schlecht wasserlösliche, chemisch komplexe Gemische• selektiv, spezifisch• empfindlich• quantifizier-, reproduzierbar (EC50, IC50)• validierbar mit entsprechender Positivkontrolle• möglichst einfach• kostengünstig
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- Bioassay-guided fractionation Pflanzenmaterial immer mit polarer werdenen LM extrahieren und auf Stoffe prüfen. Hexan -> DCM -> Ethylacetat -> Ethanol -> VLC (Vacuum Liquid Chromatography) mit Kieselgel danach DC für die Einzelstoffe
- Chemische Testung auf Radikalfänger Prinzip • Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (= ROS z.B. Hydroxyl-, Superoxid-, Lipidperoxid-,Stickoxidradikal)• beeinflussen wichtige Signalwege in normalen physiologischen Prozessen, aber auch bei Alterungs- und pathologischen Prozessen• Gleichgewicht zwischen prooxidativen und antioxidativen Prozessen• Ungleichgewicht -> oxidativer Stress -> oxidative Schädigung von Biopolymeren -> Entstehung chronischer Erkrankungen • für Flavonoide, Phenolcarbonsäuren u.v.a. in vielen in vitro Modellen Wirkung als Fängervon .OH, O.2 - , ROO. nachgewiesen• Reaktionen auf verschiedene ROS unterschiedlich Test mit DPPH• 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl-Radikal• stabiles Radikal• charakteristische UV-Absorption -> λmax 523nm -> Entfärbung• genau quantifizierbar• gute Reaktivität mit Polyphenolen• geringere Reaktivität als Sauerstoffradikale• verwendbar in DC und Spektrophotometrie • methanolische Lösung der Probe in3 abgestuften Konzentrationen + DPPH(= Probenlösung) • photometrische Vermessung von entsprechenden Probenlösungenohne DPPH-> (= „Blindprobe“) und von DPPH-> Lösung ohne Probe (=„Kontrolle“ = 100% Radikal)
- Testung auf Radikalfänger - Vorgangsweise • Extraktion von 0,10 g einer flavonoidhaltigen Droge mit 10 ml Methanol unter Rückfluss• Filtration, Nachwaschen• Eindampfen des Filtrates in austariertem Kolben• Extrakt 30 Minuten im Exsiccator trocknen!• Bestimmung des Extraktgewichtes (=Auswaage AW)• Auflösen des Extraktes (AW) in 50,00 ml Methanol • Auflösen von AW (z.B. 15mg) in 50,00 ml Methanol• 10,00 ml dieser Lösung werden mit Methanol auf 20,00 ml verdünnt (AW 1/5 in 20 ml= Stammlösung) Konzentration der Stammlösung = AW/100 in mg/ml= 0,15 mg/ml= AW x 10 in µg/ml= 150 µg/ml Untersuchungslösung 1 =1,00 ml Stammlösung (150 µg/ml) auf 10,00 ml (1:10)Konzentration = AW in µg/ml = 15 µg/ml• Untersuchungslösung 2 =2,00 ml Stammlösung (150 µg/ml) auf 10,00 ml (1:5)Konzentration = AW x 2 in µg/ml = 30 µg/ml• Untersuchungslösung 3 =5,00 ml Stammlösung (150 µg/ml) auf 10,00 ml (1:2)Konzentration = AW x 5 in µg/ml = 75 µg/ml • 3,00 ml jeder Untersuchungslösung in einer Schliffeprouvette mit 6,00 ml DPPH-Lösung versetzt (Verd. 1:3) = in Abhängigkeit der Konzentration der Radikalfänger im Extrakt Absorption bei 517 nm niedriger • „Blindproben“:3,00 ml jeder Untersuchungslösung in einer Schliffeprouvettemit 6,00 ml Methanol versetzt= gefärbte Extraktlösung ohne Radikal, umEigenabsorption der Extraktlösungen zu erfassen• Kontrolle:3,00 ml Methanol in einer Schliffeprouvettemit 6,00 ml DPPH-Lösung versetzt= 100% freies Radikal, das bei 517 nm absorbiert • nach 10 min. bei Raumtemperatur Messung der Absorptionen (A) aller sieben Lösungen gegen Methanol bei 517 nm • Berechnung:Radikalfängerwirkung in % =[1 – (AProbe – ABlindprobe)/AKontrolle] x 100
- Gewinnung des Wirkstoffkomplexes • Extraktion mit Lösungsmitteln je nach Empfindlichkeit der Wirkstoffe– in der Kälte• Mazeration• Perkolation• Ultraschallextraktion• Turboextraktion • Extraktion mit Lösungsmitteln – unter Erwärmen• Digestion = Erhitzen unter Rückfluss• Soxhlet-Extraktion • Extraktion mit Lösungsmitteln unter Druck– Extraktion mit überkritischen Gasen – Accelerated Solvent Extraction (ASE)= Pressurized Liquid Extraction (PLE) • Wasserdampfdestillation• Preßung• Sublimation
- Einfluss des Lösungsmittels auf Extraktzusammensetzung • Art– Hydrophilie, Lipophilie– Alkohole, Aceton, Glycerol, CO2!• Elutionskraft
- Vorreinigung von Extrakten • Entfernung lipophiler Begleitstoffe– Fette, Carotinoide, Chlorophyll– Ausfällung, Adsorption, Ausfrieren• Entfernung von Polysacchariden– Ausfällung• Entfernung phenolischer Begleitstoffe– Ausfällung von Gerbstoffen, Flavonoiden– Ionentausch bei Anthocyanen • Gelchromatographie• Entfernung von Salzen durch Dialyse• Fraktionierte Destillation
- Methoden zur Isolierung von Pflanzenstoffen • überwiegend chromatographische Verfahren– SC bei Normaldruck bzw. unter Vakuum (=VLC)– Flüssigchromatographie unter Druck• Flash Chromatography, LPLC• MPLC, HPLC• SFC– Verteilungschromatographie• HPCCC– Präparative DC• Kristallisation
- SC und VLC + und - • SC bei Normaldruck bzw. unter Vakuum (=VLC)– Vorteile:• sehr einfach und schnell• minimaler Aufwand• niedrige Kosten– Nachteil:• mäßige Auflösung
- Flüssigchromatographie unter Druck + und - • Flüssigchromatographie unter Druck– Flash Chromatography, LPLC– MPLC, HPLC– SFC• Vorteile:– Beschleunigung der Trennung– Erhöhung der Trennleistung• Nachteil:– teure Ausrüstung
- Verteilungschromatographie • High Performance Counter Current Chromatography (=HPCCC) – Verteilung zwischen 2 nicht mischbarenPhasen– HEMWAT-Systeme:n-Hexan-Ethylacetat-Methanol-Wasser– Phasen durch Zentrifugalkräfte im Gerät gehalten– Trennung der Analyten aufgrund des Verteilungskoeffizienten • kein fester Träger -> keine Adsorption• hohe Kapazität• kurze Trennzeiten• Extrakte ohne Verlust vortrennbar• HPLC bezüglich Auflösung unterlegen
- Kristallisation von Pflanzenstoffen • wenn ......– Substanz in relativ hoher Konzentration in Droge– spezifische funktionelle Gruppen– gut von Begleitstoffen abtrennbar– gut kristallisierbar
- Charakterisierung von isolierten Substanzen Schmelzpunkt, Siedepunkt• Chromatographische Prüfung – DC, GC, HPLC• Spektroskopische Methoden – UV/Vis, IR, FTIR, NMR• Massenspektrometrie• Elementaranalyse/hochauflösende Masse• Röntgenstrukturanalyse• Optische Drehung/Circulardichroismus
- Charakterisierung bekannter Verbindungen • Vergleich mit authentischer Substanz mittels chromatographischer Methoden• DC in verschiedenen Systemen unter Verwendung spezifischer Detektionsreagentien• GC Retentionszeit, Retentionsindices• HPLC Retentionszeit, UV-Detektion– mittels Spektroskopie• UV-Bibliotheken• IR-Bibliotheken
- IR-Spektroskopie – Valenzschwingungen– Deformationsschwingungen • im Bereich von 4000–1500 cm-1 besonders charakteristisch• zusätzlich aus Fingerprintbereich von 1500–600 cm-1 Anhaltspunkt zur Identifizierung• IR-Techniken– Transmissionmessung mit KBr-Presslingen– Fourier Transformationstechnik
- Abgeschwächte Totalreflexion (ATR) • Strahlung wird in einem Lichtwellenleiter in Totalreflexion geführt; wobei sich an der Oberfläche des Leiters ein evaneszentes Feld bildet• Proben stehen in Wechselwirkung mit evaneszenten Feld• Strahlung, die aus dem Wellenleiter austritt, wird mit Spektrometer ausgewertet• Methode eignet sich für feste und flüssige Proben • ähnliche Spektren wie bei der Transmissionsspektroskopie, aber– keine KBr-Presslinge notwendig– sehr einfache Probenbereitung– höhere Empfindlichkeit– kürzere Messzeiten
- Charakterisierung unbekannter Verbindungen • überwiegend durch Spektroskopie–1H-NMR, 13C-NMR,.......– zweidimensionale Methoden (COSY, TOCSY, NOESY,.....)• Massenspektrometrie– unterschiedliche Fragmentierungsmethoden– hochauflösende Masse• Röntgenstrukturanalyse– Kristalle!!• Optische Drehung/Circulardichroismus