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biogene am (Fach) / Teil 6 (Lektion)

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  • Reinheitsprüfung Pflanzliche Drogen = Plantae medicinales • fremde Bestandteile• extrahierbare Stoffe• Pestizidrückstände• Schwermetalle• mikrobiologische Qualität• Aflatoxine, Ochratoxin A, Aristolochiasäuren• radioaktive Kontamination -> bei verdacht• Asche, säureunlösliche Asche• Trocknungsverlust/Wassergehalt
  • Reinheitsprüfung Trockenextrakte, Dickextrakte • Trocknungsverlust/ Wassergehalt• Lösungsmittel-Rückstände• (Pestizidrückstände)• (Schwermetalle)• (mikrobiologische Qualität)• (Aflatoxine)• Trockenrückstand bei Dickextrakten
  • Pflanzliche Drogen = Plantae medicinales - fremde Bestandteile Was und Wie – Teile der Pflanze, die nicht der Definition oder Beschreibung entsprechen– Teile fremder Pflanzen– Verunreinigungen• mineralische Stoffe• Insekten• ………..– an 100 – 500 g Drogewenn keine anderen Angaben, höchstens 2% • makroskopisch (ev. 6fache Vergrößerung)• mikroskopisch• nasschemisch• Siebgröße, andere Maße• dünnschichtchromatographisch• Probennahmeentsprechend
  • Makroskopische und mikroskopische Prüfung • verfärbte Anteile, krankheitsbefallene Teile– Holunderblüten: max. 15% braune Blüten (10 g)– Eibischblätter: max. 4% mit Puccinia malvacearum– Eibischwurzel: max. 2% braungefärbte Droge • Blattstiele, Stängelanteile in Blattdrogen und Früchten– Eschenblätter: max. 3% Stängel– Melissenblätter (20g): max. 10% Stängel mit  über 1 mm– Mädesüßkraut: max. 5% Stängel mit  über 5 mm– Fenchelfrüchte: max. 1,5% Doldenstiele• Bestimmte Wurzelteile– Ratanhiawurzel: max. 5% Wurzelschopf und Wurzelnmit  über 25 mm • Hüllkelchblätter, Fruchtstücke in Blütendrogen– Ringelblumenblüten:max. 5% Hüllkelchblätter– Hibiskusblüten: max. 2% Fruchtstücke• Zweigstücke in Rinden– Weidenrinde: max. 3% Zweigstücke mit  über 10 mm• 100 bis 500 g Drogenmenge für Bestimmung bzw. Angabein Monographie
  • Siebgröße Drogen • z.B. Kamillenblütenmax. 25% der Droge durch Sieb 710 abtrennbarmit 20 g Droge bestimmt• z.B. Römische Kamillemax. 3% Blütenköpfchenmit d unter 8 mm
  • Nasschemische Prüfungen - drogen • Stärke nicht erlaubt– Knoblauch– Teufelskrallenwurzel – Prüfung mit Jodlösung unter dem Mikroskop -> ! Blaufärbung nicht zulässig ! Dünnschichtchromatographische Prüfung • extrahierbare Stoffe – definierte Menge Droge mit bestimmter Menge eines definiertenLösungsmittels unter definierten Bedingungen zu extrahieren– Extraktmenge gravimetrisch bestimmt– nur in wenigen Monographien gefordert z.B. Hauhechelwurzel, Hopfenzapfen,….– Relevanz für die Herstellung von Zubereitungen und Phytopharmaka • Pestizidrückstände (EuAB 2.8.13)– Substanzen zur Bekämpfung von Schädlingen, unerwünschten Pflanzen- und Tierarten– Grenzwerte (mg/kg) für ca.100 Substanzen (inkl. Derivate)• Organochlorverbindungen• Pyrethroide• Organophosphorverbindungen • Schwermetalle (EuAB 2.4.27)Prüfung auf Cadmium, Kupfer, Nickel, Blei, Arsen und Quecksilber mittels AAS, ICP-AESoder ICP-MS erlaubt Quantifizierung im ppb-Bereich • mikrobiologische Qualität für nicht sterile pharm. Präparate und Substanzen bzw. für pflanzliche Arzneimittel für oralen Gebrauch • Aflatoxine (EuAB 2.8.18) • Ochratoxin A (2.8.22) • Aristolochiasäuren – „Grenzwert“ 2 ppm • radioaktive Kontamination - Prüfung nur im Verdachtsfall aufgrund von EWGVerordnungen • Asche, Salzsäureunlösliche Asche– Verbrennen einer definierten Menge an Droge = Asche (EuAB 2.4.16)– Extraktion der Asche mit verdünnter HCl und Glühen = Salzsäureunlösliche Asche (EuAB 2.8.1) • Trocknungsverlust (EuAB 2.2.32)– indirekte Bestimmung des Wassergehaltes– in % (m/m) angegebener Masseverlust– verschiedene Trocknungsverfahren
  • Pestizidrückstände Chemie und Berechnung • Organochlorverbindungen• Pyrethroide• Organophosphorverbindungen • Pestizide, die weder in Tab. 2.8.13-1 noch in EU- Texten angegeben sind, nach folgender Formel berechnet: [ADI x M]/[MDDHD x 100] ADI = erlaubte Tagesdosis (acceptable daily intake) in mg/kg Körpermasse (FAO/WHO)M = Körpermasse in kg (60 kg)MDDHD = Tagesdosis der pflanzlichen Droge (maximum daily dose, herbal drug) • Pestizide, in Zubereitungen, nach folgender Formel berechnet:– DER < 10 : 1           MRLHD X DER– DER > 10 : 1           [ADI x M]/[MDDHD x 100] MRLHD = maximaler Grenzwert (maximum residue limit) des Pestizids in der pflanzlichen DrogeDER = Droge/Extrakt-Verhältnis (drug/extract ratio) • muss folgenden Kriterien entsprechen:– Methode, insbesondere Aufreinigungsschritte geeignet undnicht anfällig für Interferenzen– natürliches Vorkommen von Komponenten (z.B. Disulfide in Kreuzblütlern)wird berücksichtigt– Konzentration von Test- und Referenzsubstanzen imdynamischen Bereich des Detektors– Wiederfindungsrate 70 – 110 %– Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit nicht grösserals in Tabelle 2. 08. 13.-2
  • Schwermetalle - Probenaufbereitung und Analyse • 7 Parallelbestimmungen• pulverisierte Probe mit Salpetersäure und Salzsäure versetzt, luftdicht verschlossen• Aufschluss in der Mikrowelle in 3 Schritten nach Zusatz von Schwefelsäure -> Wiederholung des Aufschlusses• für Bestimmung mittels AAS:– Cd und Pb klare, farblose Lösungen mit Wasser und mit Mg-NitratLösung und NH4H2PO4-Lösung versetzen– ev. weitere Umsetzungen z.B. für As mit KJ• Detaillierte Vorschriften und Akzeptanzkriterien für alle Methoden zuValidierung, Spezifität, Richtigkeit, Messbereich, Wiederhol-, interneVergleichpräzision, Bestimmungs- und Nachweisgrenze
  • Schwermetalle - Grenzwerte – Blei 5,0 ppm – Cadmium 1,0 ppmAusnahmen:Erdrauchkraut 1,5 ppmWeidenrinde, Tormentillwurzelstock 2,0 ppmTang 4,0 ppmLeinsamen 0,5 ppm – Quecksilber 0,1 ppm
  • A - mikrobiologische Qualität Pflanzliche Arzneimittel, die pflanzliche Drogen enthalten, welche zur Herstellung eines Aufgusses oder Dekokts unter Verwendung von siedendem Wasser bestimmt sind– Gesamtzahl koloniebildender, aerober Einheiten: höchstens 107 Bakterien– Gesamtzahl Hefen und Schimmelpilze:105 je g/ml– höchstens 103 Escherichia coli je g/ml– Salmonellen nicht vorhanden
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  • B und C - mikrobiologische Qualität Pflanzliche Arzneimittel, die Extrakte und/oder pflanzliche Drogen enthalten, deren Herstellungsverfahren oder Vorbehandlung den Gehalt an Mikroorganismen so weit reduziert,dass er nachfolgenden Kriterien entspricht: – Gesamtzahl koloniebildender, aerober Einheiten: höchstens 104 Bakterien– Gesamtzahl Hefen und Schimmelpilze: höchstens 102 je g/ml– höchstens 102 gramnegative Bakterien je g/ml– Escherichia und Salmonellen nicht vorhanden C Gehalt an Mikrorganismen nicht ausreichend reduziert, um Kategorie B zu entsprechen: – Gesamtzahl koloniebildender, aerober Einheiten: höchstens 105 Bakterien– Gesamtzahl Hefen und Schimmelpilze: höchstens 104 je g/ml– höchstens 104 gramnegative Bakterien je g/ml– Escherichia und Salmonellen nicht vorhanden
  • Durchführung der Prüfung - mikrobiologische Qualität • Zählung auf Agarplatten• Zählung mit Hilfe von Verdünnungsreihen• Selektive Medien für Entero- und andere gramnegative Bakterien
  • Aflatoxine - toxische Inhaltsstoffe – im EuAB 6 erstmals Limit für Aflatoxin B1• Grenzwert Aflatoxin B1 2 µg/kg– optionaler Grenzwerte für andere Aflatoxine• Summe Aflatoxine B1, B2,G1,G2 4 µg/kg • Probenvorbereitung:– Vorreinigung aller Glasgeräte mit 10% H2SO4– Schutz vor UV-Licht erforderlich!– Extraktion der Probe mit 70% Methanol im Ultraschall und Filtration– Verdünnung mit Wasser – Anreicherung über Immunaffinitätssäule mit Antikörpern gegen Aflatoxin B1 mit einer Kapazität von 100 ng• Probe aufbringen• mit Wasser waschen• Aflatoxine mit Methanol eluieren – Quantifizierung mittels UV-Spektroskopie zur Herstellung von Referenzlösungen für die HPLC• Konzentration Aflatoxin B1 100 ng/ml • Quantifizierung mittels RP-HPLC– stationäre Phase: RP-18– mobile Phase: Acetonitril-Methanol-Wasser– Nachsäulenderivatisierung mit Pyridiniumbromidperbromid, elektrochemisch generiertem Brom oder photochemischen Reaktor– Fluoreszenzdetektion– 5-Punkt Kalibrierung mit Aflatoxin B1 (1-8 μg/kg Droge)– Für Aflatoxine B2 ,G1 und G2 Nachsäulenderivatisierung z.B. mit Pyridiniumbromidperbromid erforderlich• Methode geeignet für Ingwerwurzel, Sennesfrüchte oder Teufelskrallenwurzel,für andere Drogen Validierung notwendig!
  • Ochratoxin A - toxische Inhaltsstoffe – im EuAB 6.6 erstmals Bestimmung– Limit für Süssholzwurzel und Süssholzwurzelextrakt– Grenzwert 20 µg/kg • nephrotoxisches Mykotoxin aus Aspergillus-Arten• Probenvorbereitung:– in Detergentien-freien Glasgefässen !– Extraktion der Droge mit NaHCO3 -Lösung– Verdünnung mit Puffer pH 7,4– Immunoaffinitätschromatographie mit Antikörpern gegen Ochratoxin A (Kapazität für mindestens 100 ng)– Waschschritte mit Puffer und Wasser– Elution von Ochratoxin A mit Methanol • Analytik mittels HPLC– Stationäre Phase: RP-18– Gradientenelution mit Wasser (pH 2,8)- Acetonitril– Fluoreszenzdetektion– 7-Punkt Kalibrierung mit Ochratoxin A für Konzentrationsbereich, der 0,5 bis 250 µg/kg Droge abdeckt• Grosse Vorsicht beim Einwiegen von Ochratoxin!• Eignung des Analysenverfahrens muss für jede Droge überprüft werden!• Dekontamination der Glasgefässe mit NaClO!
  • Aristolochiasäuren – für Monographien pflanzlicher Drogen, die nach chemotaxono-mischem Kenntnisstand frei von Aristolochiasäuren sind, aber möglicherweise Verfälschungen aufweisen können– derzeit Limit für Stephaniae tetrandrae radix, Clematidis armandii caulis, Akebiae caulis, Auklandiae radix, Sinomenii caulis– „Grenzwert“ 2 ppm • hochtoxische Substanzen– kanzerogen– nephrotoxisch– genotoxisch• in der Familie der Aristolochiaceae Prüfung auf Aristolochiasäuren• Methode A = Screening mittels DC und Vergleich mit Aristolochiasäure I und II; bei Zonen mit gleichem Rf und gleicher Fluoreszenz • Methode B = Identifizierung von Aristolochiasäure mittels HPLC und semiquantitativer Vergleich mit externem Standard einer Konzentration von 2 ppm • Methode C = Bestätigung des Vorliegens mittels LC/MS
  • Asche, Salzsäureunlösliche Asche – Verbrennen einer definierten Menge an Droge = Asche (EuAB 2.4.16)– Extraktion der Asche mit verdünnter HCl und Glühen = Salzsäureunlösliche Asche Asche enthält: nicht flüchtige, anorganische ZellbestandteileCalciumpektinat, OxalateVerunreinigungenMineralische BestandteileErde, Sand - maschinelle ErnteSalzsäureunlöslich !VerfälschungenCaCO3 - Althaeae radixBaSO4 - Beschwerungsmittel Berechnung des Aschengehaltes: % Asche = [AW x 100]/[EW]
  • Durchführung der Aschebestimmung • 1 g Droge im gewichtskonstanten Tiegel 30 min. zur schwachen Rotglut (600°C) erhitzen• Erkalten im Exsiccator (30 min.)• bis Gewichtskonstanz• Fehler: • Leergewicht des Tiegels bestimmen• Entflammen vermeiden !
  • Durchführung der Bestimmung der Salzsäureunlöslichen Asche • Asche mit verdünnter HCl erhitzen• nach dem Abkühlen durch aschefreies Filter filtrieren und mit heissem Wasser säurefrei waschen• Filter mit säureunlöslicher Asche trocknen und wieder veraschen
  • Bestimmung des Trocknungsverlust  Vorgeschriebene Menge Droge oder Trockenextrakt in Wägeglas im Trockenschrank bei angegebener Temperatur (103-105°C) bis zur Massekonstanz getrocknet 2,0000 - 3,0000 g Drogeneinwaage in Wägeglas (bereits konstant getrocknet) 1 Stunde bei 103 - 105°C im Exsiccator abkühlen lassen Achtung: speziell bezeichneten Trockenschrank verwenden% Trocknungsverlust = [(EW-AW) x 100]/EW Üblicherweise bei Drogen max. 10% (6-12%)
  • Trocknungsverlust - Wasserbest. - Trockenextrakte • Trocknungsverlust (EuAB 2.8.17) 0,5 g Extrakt in Wägeglas 3 h bei 103 – 105°C getrocknetnach dem Abkühlen im Exsiccator Wägung • Wasser - Halbmikrobestimmung durchKarl-Fischer-Methode (EuAB 2.5.12)Für Extrakte mit flüchtigen Bestandteilen basiert auf quantitativer Reaktion von Wasser mit Schwefeldioxid-Iod-Reagenz in wasserfreiem, basischem MediumSO2 + J2 + 2 H2O → H2SO4 + 2 HJautomatische Endpunktbestimmung mittels Indikatorelektroden
  • Trockenextrakte - Lösungsmittel-Rückstände – Ausführung (EuAB 2.4.24)– Grenzwerte (EuAB 5.4)– GC-Grenzprüfung von Lösungsmitteln der Klasse 1 und 2• Klasse 1: LM, die zu vermeiden sind (Benzol, CCl4,..)• Klasse 2: LM, die in der Anwendung zu begrenzen sind(Acetonitril, Chloroform, Hexan, Methanol, Toluol,….) • Head-space-Analyse für flüchtige Verbindungen in festen oder flüssigen Proben• unterschiedliche Probenvorbereitung für wasserlösliche und nicht wasserlösliche Substanzen• 2 verschiedene GC-Methoden– System A für Analyse– System B für Identitätsbestätigung
  • Anforderungen an mikrobiologische Qualität • Kategorie B (oder C)• Gesamtzahl koloniebildender, aerober Einheiten: höchstens 104 Bakterien und 102 Pilze je g oder ml• Spezifizierte Mikroorganismen:– höchstens 102 gramnegative Bakterien je g– Salmonellen, Staphylococcus aureus und Escherichia coli dürfen nicht vorhanden sein
  • Tinkturen - Prüfung auf Reinheit • relative Dichte• Ethanolgehalt• Methanol, 2-Propanol• Trockenrückstand• Pestizidrückstände• Schwermetalle• mikrobiologische Qualität• Aflatoxine
  • Tinkturen - relative Dichte d20 = Verhältnis zwischen Masse eines bestimmten Volumens einer Substanz und der Masse des gleichen Volumens von Wasser bei 20°C • Bestimmung mittels– Pyknometer– hydrostatischer Waage– Aräometer– digitalem Densitometer
  • Tinkturen - Ethanolgehalt Zur Feststellung, ob – zur Herstellung richtige EtOH-Konzentration verwendet wurde (Tinktur - 70% EtOH)– Zubereitung nachträglich durch Verdünnung z.B. mit H2O etc. manipuliert wurde– Angabe in % (V/V) Bedeutung der richtigen Ethanolkonzentration bei Herstellung Einfluß auf Wirkstoffspektrum (Löslichkeit der Inhaltsstoffe) Konservierungsmittel für Aufbewahrung nachträgliches Verdünnen -> Wirkstoffe können ausfallen (Löslichkeit!) Begleitstoffe können ausfallen und Niederschlagadsorbiert Wirkstoffe -> WIRKSTOFFABNAHME Möglichkeiten zur Bestimmung des Ethanolgehaltes • Dichtebestimmung nach Destillation• Head-space Gaschromatographie• Gaschromatographie Brechungsindex Wärmeausdehnungsvermögen gelöste Stoffe in flüssigen Zubereitungen stören -> Destillation der Probe nach Wasserzusatz
  • Tinktur Ethanolgehalt Durchführung + Berechnung  25,0 ml Probe + ca. 100 bis 150 ml H2O  Destillation 90 ml Destillat in 100 ml Messkolben auffangen 30 Minuten Temperaturausgleich auf 100,00 ml auffüllen und gut mischen (Verd. 1:4) Destillat in Pyknometer einfüllen Masse bestimmen ρ = [b - p]/Vb = Gewicht des mit Destillat gefüllten Pyknometers in gp = Gewicht des leeren Pyknometers in gV = Volumen (10 ml)-> Ablesung in Tabelle
  • Bestimmung des Ethanolgehaltes mittels GC • Head-space Bestimmung– Erstellung einer Eichgeraden (3-Punkt-Eichung) mit Ethanol und Propanol als internem Standard– Injektion der Gasphase von Proben und Standards– Gradientenelution und FID-Detektion– Suitability-Test mit Methanol:Auflösung der Peaks von Methanol und Ethanol mindestens 5– Quantifizierung des Ethanols • GC-Bestimmung– Injektion einer wässrigen Lösung der Probe und des Standards– GC-System, Suitability-Test wie oben • Prüfung auf Methanol und 2-Propanol (EuAB 2.9.11):– Maximal 0,05% (V/V) Methanol– Maximal 0,05% (V/V) 2-Propanol Methanol, 2-Propanol– Bestimmung mittels GC bzw. Headspace-GC:– Destillation der Probe– Zusatz von internem Standard (= 2,5% Lösung von 1-Propanol)– Verdünnung auf Gehalt von 10% Ethanol– GC-AnalyseReferenz = Lösung von 10% Ethanol, internemStandard, 0,05% Methanol und 0,05% 2-Propanol
  • Tinkturen - Trockenrückstand – gravimetrische Bestimmung– Probe in Wägeglas am Wasserbad eingedampft– danach 3 h bei 100-105°C getrocknet, über Nacht über Phosphorpentoxid oder Silicalgel weitergetrocknet und danach gewogen

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