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Photosynthese (Fach) / VL2 (Lektion)

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• Funktionen von Membranproteinen 1. Inter- und Intrazelluläre Kommunikation 2. Transport von Nährstoffen 3. Bereitstellung von Energie für Zellen 4. Primärprozesse der Photosynthese und Atmungskette
• X-ray vs. Cryo-EM X-ray: Röntgendiffraktionsmethode → Kristalle züchten sehr schwierig → sehr hohe Kosten → Mikrokristalle 20-50µm groß Cry-EM: Revolution der Kristallografie: Struktur ohne Kristall → keine Kristallsuche → hochauflösende Struktur von Proteinkomplexen in Lösung
• Struktur des Photoreaktionszentrums von Purpurbakterien - zuerts von Michel und Deisenhofer - solubilisierten Protein mithilfe von Detergenz aus Membran - Aktivität von Protein blieb erhalten → 1. Kristalle, Durchbruch Struktur von RZ: 4 UE: L, M, H, C l, M Heterodimer: Reaktionszentrum mit Redoxfaktoren H: Alpha- Helix C: Cytochrom C Typ mit 4 Hämgruppen
• Typ 1 Kristalle Lipid- Würfel (lipid- cubic- phase) - rekonstrukierte 2D Membranen wechswelwirken - Proteine sind sehr dicht gepackt, sehr regelmäßig angeordnet
• Typ 2 Kristalle Protein- Detergenz- Myzellen - Kristallisation mittels Detergenz und Fällungsmittel - Detergenz wechselwirkt mit hydrophoben Gruppen des Proteins, liegt im Zischenraum → meist keine hoch geordneten Kristalle → Problem: Struktur weiß man vorher nicht → große Abstände zwischen Proteinen, ungeordnete Strukturen
• Mizellenbildung CMC= kritische mizellare Konzentration Mizzelen stehen im dynamischen Gleichgewicht mit monomerer Form des Detergenzes, Konzentration der Monomere entspricht CMC! CMC wird durch Detergenz bestimmt Natur und Konzentration des Salzes beeinflussen CMC → je größer CMC desto schneller der Austausch zwischen den beiden Formen
• Übersättigung β Übersättigung= Differenz des chemischen Potenzials zwischen Lösung und Festkörper Chemisches Potential der gelösten Substanz > als das im Festkörper β= µis-µic
• Phasendiagramm Einteilung in 4 Zonen nach Grad der Übersättigung einer Lösung: - ungesättigt (
• Etkläre das Phasendiagramm mit 4 Zonen! 1. ungesättigt: Monodisperse Proteinlösung, Proteine von Solvent umgeben, zufällige Orientierung 2. Metastabile Zone: Übertreten der Löslichkeitsgrenze 2a. Heterogene Nukleatiarionszone: keine spontane Kristallisation Wachstunm von vorhandenen kristallinen Keimen b. Homogene Nukleationszone: Spontane Keimbildung, Wachstum der Kristalle mit der Zeit langsamer 5. Präzipitatzone: Amorphoes Präzipitat, Aggregation
• Welche Rolle spielt die Salzkonzentration? - verringert Löslichkeit von Proteinen - schirmt Ladungen auf Oberfläche der Proteine ab, verhindert Abstoßung gleich geladener Proteinmoleküle - bestimmt Ionenstärke im Solvent
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• Welche Kationen und Anionen stabiliserien die Konformation von Proteinen (Reihenfolge von hoher Stabilisierung zu niedriger Stabilisierung)? Kationen: Li+ >Na+>K+>NH4+>Mg2+ Anionen: SO42->PO43->Cl->NO3->ClO3-
• Was ist Salting in? weniger Salz: Oberflächenladungen stehen wieder zur Verfügung, wurden vorher abgeschirmt - Proteine kristallisieren durch elektrostatische Wechselwirkungen
• Was ist salting out? viel Salz: Proteine sind sind in Konkurenz mit Wasser - Löslichkeit der Proteine nimmt ab - zwischen Membranproteinen: hydrophobe Wechselwirkungen, Kristallisation
• Nenne weitere Fällungsmittel (nicht Salze!) und erkläre deren Effekt auf die Löslichkeit Organische Polyalkohole PEG 400-6000 und PEG MME - milde Eigenschaften 1. Erniedrigt Proteinlöslichkeit: Konkurenz um Wasser, entzieht Protein Wasser, hydrophober Effekt, Kristallisation 2. PEG beeinflusst CMC: Einfluss auf Löslichkeit der Detergenz- Monomere durch Ww mit Detergenz 3. Gefrieschutz für Kristalle: als Cryo- Lösung bei X-ray- Messungen
• Wie beeinflusst der pH die Kristallisation? pH sollte möglichst nahe am isoelektrischen Punkt (pI, negative und positive Ladungen gleichen sich aus) liegen - Nettoladunge =0 → Löslichkeit am Geringsten - Solvatisierungsenergie wist am pI gering - optimaler pH liegt ca. 1,5 über oder unterhalb des pI
• In welchen Lösungen erfolgt Kristallisation? - metastabile und übersättigte Lösung → Nukleation muss stattfinden - in homogener Lösung
• Nenne beliebte Kristallisations-Techniken! 1. Dampfdiffusion (Tropfen Proteinlösung und Tropfen Fällungsmittel meist 1/1 vermischt in Well inkubieren) 2. Hanging und Sitting Drop 3. Batch (Microbatch, Proteine und Fällungsmittel werden direkt miteinander vermischt) 4. Dialyse (Makrokristalle, Dialysemembran zwischen Proteinen und Fällungsmittel) 5. Diffusion mit Matrices
• Thermodynamik bei der Kristallbildung Kristallbildung führt zu Entropie-Verlust, wird teilweise durch Entropiegewinn von entwichenem Wasser aus Solvathülle kompensiert Löslichkeit ist Temperaturabhängig! (durch Diffusion) ΔG=ΔH*TΔS Gibbs- Energie= Enthalpie* Temperatur* Entropie Enthalpie=Differenz von Protein-Protein-Energie und Solvatisierungsenergie wenn Differenz kleiner als Entropie ist Entropie entscheidend wichtig: langsames herausholen der Kristalle, sonst Aggregation
• Wie erzeugt man PSI- Kristalle ohne Seeding (Impftechniken)? Keimbildung in labiler Zone, beginnt in metastabiler Zone, da Abnahme der Übersättigung Wachstum der Kristalle wird durch Konzentrationsgradient induziert → ist Reaktion zu schnell kann metastabile Zone nicht erreicht werden. dann nur weitere Keimbildung, viele Microkristalle
• Erkläre die beiden Seedingmethoden! Mikroseeding: - kleine zerkleinerte Kristalle werden mithilfe von Haar in Stamm- Lösung mit geringer Konzentration überführt Makroseeding: - nur 1 Kristall wird in Lösung mit den gleichen Bedingungen überführt - Herstellung einer Stammlösung für Microseeding
• Warum ist es schwierig Membranproteinkristalle herzustellen? - sehr komplex, labil und dynamisch - haben größere Elementarzellen, hoher Solvenzgehalt weil dieses die natürliche Konformation der Proteine im Kristall stabilisiert - Solvenz muss im Kristall bleiben sonst trocknet er aus und zerbricht - dann aber das Problem: schlechte optische Eigentschaften, geringe Streuung
• Was hat ein Membranproteinkristall für Eigenschaften? - haben schwache WW - nicht sehr hart, zerbrechlich, enpfindlich - 3-12 intermolekulare Kontakte pro Molekül - Sovlens kann an Protein binden - bidentate organische Säuren und Metallionen bilden intermolekulare Kristallkontakte
• Wie gehe ich vor um stabile Suaerstoffaktive PSII- Kristalle mit guter Auflösung zu erzeugen? 1. Proteine aus thermophilen Cyanobakterien anziehen 2. Zellaufschluss und Solubilisierung (Abhängig von Detergenz) 3. Detergenz- Wahl: zu berücksichtigen sind Stabilität, Aktivität, Proteinzusammensetzung und Homogenität 4. Aufreinigen des Proteins: trennen von PSI, ATP- Synthase, Antennen 5. Proteinanalyse 6. Protein- Homogenität feststellen (mit DLS, Dynamischer Licht- Streuung) 7. Wahl der Kristallisationsbedingungen (Puffer, Fällungsmittel, Phasendiagramm) 8. Kristalle analysieren, X-ray
• Wie reinigt man PSII auf? mit 2* Anionenaustauscher- Säule 1. von Phycobillisomen, PSI 2. von weiteren Antennen, PSII- Monomeren und PSII- Dimeren
• Warum wird das Protein per Gelfiltration gereinigt? Trennung der Makromoleküle aufgrund des Molekulargewichts (Mono und Dimere werden getrennt) Substanzen lassen sich gut trennen - geringer Velrust an Substanz Es ist wichtig homogene Lösung zu erhalten!
• Welche Informationen liefert die DLS? Diffusionskoeffizient D Hydrodynamischer Radius: Rh → Größe der Partikel wenn der sich ändert heißt dass wahrscheinlich Konformationsänderung Aggregationseffekte (Polydispersität), ist die kleiner als 15% ist Lösung homogen
• Was wird bei DLS gemessen? Streulicht eines Lasser an einer Probe Brownsche Molekularbewegung der Partikel bringt Interferenz - Messen von zeitabhängigen Intensitätsfluktuationen des gestreuten Lichts basiert auf Stokes- Einstein- Gleichung: D=     kT           6*pie*η0*Rh Rh = hydrodynamischer Radius
• Welche beiden Detergenzen werden am häufigsten verwendet? Octyl-beta-Glycosid (OG) beta- Dodecylmaltosid (DDM)
• Wie kann die Qualität von PSII Kristallen verbessert werden? 1. Einführung von His-Tag (Proteinreinigung) 2. Mehrmaliges Umkristallisieren 3. Variation des Detergenz 4. Verwendung von Additiven 5. Variation der Methoden 6. Antikörper 7. Dehydratisierung (wichtig)

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