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Epigenetik und Chromatin (Fach) / VL6 (Lektion)
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- Transkriptionelle Einheit bei Eukaryoten - Promotor komplexer - Enhancer bindet Regulatoren und TFs - Silencer - Enhancer können unterschiedliche Entfernungen zum Promotor haben
- Was kann bei der Transkription von Eukaryoten reguliert werden? 1. In welchem Zelltyp? 2. Wieviel? 3. Wann?
- Wie kann Korrelation von Chomatin und Transkriptionszustand untersucht werden? mithilfe von ChIP - suche kleine bekannte Region: ChIP + qRT - große bekannte Region: ChIP-Chip - ganze Genomlibrary: ChIP- Seq
- Wo methylieren DNA-Methyl- Transferasen? in CG- Dinukleotiden (sind Mini-Palindrome) → CpGs
- Wann wird methyliert? - nicht während Replikation (dann halbmethylierter Zustand) - nach Replikation: Umwandlung in Vollmethylierten Zustand Mechanismus: Dnmt1
- Welche beiden Methylierungsmechanismen gibt es? 1. Denovo-Methylierung: Dnmt3a und b 2. Aufrechterhaltung: Dnmt1
- DNA- Methyltransferasen Dnmt2: tRNA Methyltransferase Dnmt3a und b: hat PWWP- Domäne Dnmt3a bindet H3K36me2 und me3 PCNA: Replikationsfaktor, bringt Protein an frisch replizierte DNA
- Wie kann DNA- Methylierung verloren gehen? 1. passiv durch Replikation 2. Aktiv durch DNA- Demethylierung → Eraser
- Was sind Eraser der DNA- Demethylierung? TET- Enzyme (Ten- eleven translocation): wandeln 5- Methyl- Cytosin in 5- Hydroxy- Methyl- Cytosin um und können noch weiter oxydieren - Entfernen einer Methylgruppe durch Erzeugung einer Hydroxygruppe - dann kommen Thymin- DNA- Glykosylasen und schneiden oxidierte Form raus (erkennen Stelle als Schaden) → Basen- Excisions- Reparatur
- Beschreibe Ablauf der Cytosin-Demethylierung! Mythsliertes Cytosin wird von TET oxidiert → 5mC wird weiter oxidiert mit TET zu 5hmC, weiter zu 5fC, weiter zu 5caC - oxidierte Form wird mithilfe von TDG (Thymin DNA Glykoylasen) rausgeschnitten - entstandene A-basische Während Basen- Excisions- Reparatur wird intaktes Cytosin eingebaut
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- Wie kann DNA- Methylierung detektiert werden? 1. DNA- Bisulfit- Sequenzierung 2. MeDIP- ChIP oder Seq 3. HPLC/MS (DNA wird in Nukleotide zerstückelt, dann analysiert, aber Sequenzkontext geht verloren!) 4. Methylierungssensitive Restriktionsenzyme (Schneiden wenn methyliert, dann Southern blot)
- Wie verläuft DNA- Bisulfit- Sequenzierung? - Bisulfit konvertiert Cytosin in Uracil - wenn Cytosin methyliert bleibt es so (Schutz vor hydrolytischer Desaminierung) 1. Bisulfit- Konvertierung (unmethylierte Cs werden zu U) 2. Amplifizierung mit PCR (U wird umgeschrieben in T) 3. Auswertung
- Wie kann Bisulfit- Sequenzierung ausgewertet werden? 1. Sequenzieren der PCR- Produkte (T und C- Peaks werden überlagert, aber Anteil schwer zu quantifizieren) 2. Subklonierung in Vektor: in jeden Vektor wird nur 1 Molekül kloniert, dann Sequenzierung, Vorteil:bei Hemimehtylierter DNA wird immer nur 1 Molekül in Vektor kloniert, so kann Methylierungsrate bestimmt werden, Klone werden einzeln sequenziert - für gute Auflösung müssen bei geringer Methylierungsrate unheimlich viele Klone erzeugt werden
- Wie wird bei der Bisulfit- Sequenzierung sequenziert? - Sanger oder Hochdurchsatz- Sequenzierung - Hochdurchsatz- S. wird genommen um Subklonierung zu umgehen Lösung: PCR- Produkte mit Hichdurchsatz sequenzieren, am schnellsten
- Was sind die Schwierigkeiten beim Whole Genome Bisulfite Sequencing? 1. Bei geringer Methylierungsrate ist es schwer einzuschätzen ob es sich um Methylierung oder unvollständige Konversion handelt 2. Bisulfit funktioniert nur zu 95% (konvertierte Cs werden als 5mCs interpretiert) 3. Es muss Konversionsrate aller Cs bestimmt werden, die nicht im CG-Kontext sind, wird als Hintergrund definiert → impliziert dass Cs ohne G nicht methylierbar sind, stimmt aber nicht 4. Oxidationsstufen von 5-Hydroxy-Methyl-Cytosin werden nicht unterschieden 5. Cytosine sind im Genom nicht überall gleich zugänglich wegen Sekundärstruktur der DNA 6. 5- Methyl- Cytosin kann nicht von 5- Hydroxy- Methyl- Cytosin unterschieden werden (kann umgangen werden durch Oxi-Bisulfit- Sequenzierung)
- Wie wird CpG repliziert? - Stränge geschmolzen, Neusynthese, Einbau von nicht methyliertem C in Gegenstrang → hemimethylierter Zustand - dann methyliert Dnmt 1 Strang neu
- Wie weiß Dnmt3a wo sie methylieren soll? hat Motiv das Methyl-Lysin am Histon lesen kann PWWP- H3K36me2/3 DNA- methylierung und Histon- Methylierung sind verknüpft
- Bau Methyltransferasen Regulatorische Domäne von Dnmt1 besteht aus: PCNA: Prozessivitätsfaktor der Replikation (bringt Dnmt1 zu frisch replizierter DNA) CXXC: Motif für Bindung an unmethylierter DNA BAH: Chromatin Reader
- Wie kann bei der Bisulfit- Sequenzierung zwischen Oxidationsstufen unterschieden werden? NaRuO4 → oxidiert nur 5- Hydroxy- Methyl- Cytosin es liegt nur 5fc konvertiert vor Gob Unterscheiden der Oxidationsstufen möglich
- Welche Cs sind methyliert im Genom? - 70% aller CpGs - repetitive Sequenzen (Satelliten- DNA, Transposons, SINE, LINE) - nicht repetitive intergenische Sequenzen - Exons
- Welche Cs sind meist nicht methyliert? CpG- Islands, oft in Promotor- Region
- Andere Methode zum Nachweis von Methylierung Me-Dip (Methyl-DNA- Immunpräzipitation) Mit Antikörpern gegen α- 5mC Sequenzierung und Micro- Array Problem: AK ohne Sequenz nicht zu 100% spezifisch Vorteil: weniger zu sequenzieren
- Welche Konsequenzen hat Methylierung auf Sequenz? - Hydrolytische Desaminierung (5mC→ T, C→ U) findet auch spontan statt, Reperaturmechanismus erkennt TG- Mismatch - Wahrscheinlichkeit dass richtiger Strang repariert wird liegt nur bei 50%! - wenn falscher Strang: Mutation - deswegen gibt es nicht so viele CGs
- Können Methyltransferasen gehemmt werden? Ja Azacytidin ist zB. Derivat von Nukleotiden, wird in Erbgut eingebaut, wenn Dnmt kommt fungieren sie als Falle und binden sie - zur Behandlung von Krebs - Inhibition nicht selektiv, globale Nebenwirkungen - Therapie: Kombi aus Dnmts- Hemmern mit Histon. Deacetylase- Inhibitoren