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Biomoleküle und Zelle (Fach) / Anwendungen (Lektion)
- Anwendungen DNA-Replikationen ➢ DNA-Sequenzierung ➢ PCR (polymerase chain reaction) Gezielte in vitro-DNA-Replikation und die Erzeugung von Kettenabbrüchen(chain termination) bei der Synthese war die Voraussetzung für effiziente DNA- Sequenzierung und die Durchführung von Genomprojekten. PCR (Polymerase-Kettenreaktion) hat es ermöglicht Genfragmente gezielt zuamplifizieren. Neben der DNA-Sequenzierung hat PCR eine wichtige Bedeutung in fast allen Disziplinen der Biologie/Medizin in Forschung und Anwendung.
- DNA-Sequenzierung 1.) Biochemischen Methode nach Sanger • „Neusynthese eines klonierten DNA Fragments in vitro“ (1 Strang des Fragments dient als template) • Erzeugung von 4 Fragmentpopulationen für G-, A-, T-, C-basenspezifischer Kettenabbrüche während der Synthese in vitro (mittels DNA-Polymerase) • Markierung der Fragmente bei der Synthese, damit man sie nach der Gelelektrophorese identifizieren konnte 2.) Chemische Methode nach Maxam/Gilbert • Verwendung klonierter dsDNA-Fragmente, 1 Strang wird am Ende radioaktiv markiert • Erzeugung von 4 Fragmentpopulationen für G-, A-, T-, C-basenspezifischerKettenabbrüche durch chemische Reaktionen in vitro
- DNA-Sequenzanalyse per „Auge“! • Auftrennung der Fragmente, die in basen-spezifischen Reaktionen erzeugt werden, durch z.B. Gelelektrophorese und Auto-Radiographie (wenn die Primer radioaktiv markiert waren) • Auftrennung nach Größe • Lesefolge von unten nach oben:
- Voraussetzung für die PCR Anwendung bekannte T eilsequenz des DNA templates Synthetische DNA primer-Paare (je ein primer/Strang) Thermo-stabile DNA Polymerase (Taq aus Thermus aquaticus, thermophiles Bakterium) dNTPs (Substrat für DNA Synthese) Thermocycler (Gerät für schnelle Variation der Reaktionstemperatur)
- PCR (polymerase chain reaction) Konzept: gezielte Amplifikation von DNA Fragmenten (Genen) Vorteil: Geringe Ausgangsmenge an template(DNA oder RNA, im Extremfall nur 1 Molekül) Anwendungen (u.a.): Diagnostik in Medizin, Forschung, KriminalistikMarker für GenkartierungenIsolierung von GenenGenmanipulationenNext generation sequencing
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