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Biomoleküle und Zelle (Fach) / Restriktion-Gentechnik (Lektion)
- Geschichte der Gentechnik 1962 Arber: DNA-Restriktions-/-Modifikationssystem, Restriktionsenzyme (Nathans + Smith) 1967 Gellert: DNA-Ligase 1968 Mandel, Higa: DNA-Transformation bei E. coli nach Ca2+ -Behandlung 1972/73 Boyer, Cohen, Berg: Klonierung von EcoRI Fragmenten 1975/77 Sanger, Gilbert: DNA-Sequenzierung
- Experimente von Arber: Phage Lambda kann sich gut auf E. coliStamm B vermehren; jeder Phage führt nach Infektion einer E. coli Zelle zu einem Plaque(Plattierungseffizienz: 1) Phage Lambda vermehrt sich aber nur schlecht auf E. coli Stamm A,nur etwa jede 1000. Infektion einer Zelleführte zu einem Plaque – “Restriktion“(Plattierungseffizienz: 0,001) Allerdings zeigten die Lambda-Phagen, die sich auf Stamm A vermehrt hatten, bei Re-Infektionvon Stamm A einePlattierungseffizienz von 1! - “Modifikation"
- Restriktions/Modifikationssystem: Abwehrsystem gegen fremde DNA z.B. Phagen DNA • Methylase arbeitet eng zusammen mit dem Restriktionsenzym• Schutz vor Abbau der eigenen DNA!
- Klonierung in einen Plasmidvektor Plasmide Ringförmige, extrachromosomale DNA-Moleküle, die sich autonom replizieren können und bei der Zellteilung auf die Tochterzellen verteilt werden. Natürlich vorkommende Plasmide: Fertilitätsplasmide (F-Plasmide, kodieren transfer-Gene für Konjugationstransfer),Resistenzplasmide (R-Plasmide, kodieren multiple Resistenzgene),Virulenzplasmide (kodieren Pathogenitätsfaktoren) Inkompatibilitätsgruppen: bis zu sieben Plasmide können gleichzeitig in einer E.coli Zelle vorkommen, wenn sie kompatibel sind. Einteilung in Inkompatibilitätsgruppen (ca. 30), behindern entweder die Aufnahme oder die Replikation. Vektoren: von natürlichen Plasmiden abgeleitet
- Kopienzahl und Größe von Plasmiden Die Replikation von Plasmiden ist unabhängig von der zellulären DNA-Replikation und kann auf zwei verschiedenen Arten kontrolliert werden. Single- oder Low-copy: Plasmid-Replikation und Replikation der Wirts-DNAsind eng miteinander gekoppelt. Diese Plasmide kommen in der Zelle in geringer Zahl (1-2 Kopien) vor und werden als low-copy-number Plasmide bezeichnet. High- oder multi-copy : Die Plasmide replizieren vollständig unabhängig vonder Wirts-DNA. Sie liegen in hohen Kopiezahlen von 20-200 in der Zelle vor und werden als high-copy-number oder multi-copy Plasmide bezeichnet. Bei high-copy-number Plasmiden liegt die Kopiezahl per Definition über 20.
- Genbibliothek Eine Anzahl von Bakertienklonen oder Phagen, die ein gesamtes Genom repräsentieren Genomisch: alle Sequenzen eines Genoms cDNA: nur die transkribierten Gensequenzen (reife mRNAs werden über den Poly-A-Schwanz isoliert und dann mit reverser Transkriptase in copyDNA umgeschrieben)
- Restriktions-/Modifikationssysteme Bakterien können über Restriktions-/Modifikationssysteme eingedrungen Fremd-DNA abbauen.Dabei erkennt das Restriktionsenzyme die fremde DNA an einer bestimmten Erkennungssequenz und schneidet diese, die eigene DNA wird durch Methylierung vor dem Abbau geschützt.
- Typ II-Restriktionsenzyme Nur Typ II-Restriktionsenzyme eignen sich für die Gentechnik, da Erkennungsstelle und Schnittstelle identisch und damit genau definiert sind und Restriktions- und Modifikationsenzyme als getrennte Proteine vorliegen und arbeiten.
- Plasmidvektoren Plasmidvektoren brauchen einen ori , sollen möglichst eine hohe Kopiezahl aufweisen, brauchen Selektionsmarker für die Transformation und die Klonierung und dürfen keinen oriT und auch keine Transfergene aufweisen.
- Genklonierungen Man kann auch mit Hilfe von Lambda-Rekombinationsstellen und - enzymen oder mit Hilfe der Topoisomerase Genklonierungen durchführen.
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