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Biomoleküle und Zelle (Fach) / DNA-Replikation (Lektion)

Diese Lektion wurde von MarekHeuberger erstellt.

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• Replikationsmodus (2) • Konservativ: 1x beide Stränge alt. 1x beide Stränge neu • Semi-konservativ: 2 x 1 Strang neu, 2x 1 Strang alt • Dispersiv: 2x in beiden Strängen alt und neu gemischt
• Die DNA-Polymerase hat eine Korrekturlese-Funktion (3 ́-5 ́ Exonukleaseaktivität) ➢ Ohne Korrektur-Funktion (proof-reading) käme es alle 10^4-10^5 Nukleotide zu einem falschen Einbau ➢ Mit Korrekturfunktion nur alle 10^6-10^7Nukleotide
• Replikationsmodus (3) semi-diskontinuierlich Beide Stränge müssen in nur einer, der 5‘-3‘-Richtung synthetisiert werden An der Replikationsgabel müssen beide Stränge gleichzeitig repliziert werden Deshalb:➢ Leitstrang kann kontinuierlich,➢ der Folgestrang nur schrittweise in kurzen Stücken synthetisiert werden („Okazaki-Fragmente“) Diese Okazaki- Fragmente werden später durch Ligase zu einer hochmolekularen DNA verbunden
• Funktionsweise der DNA-Topoisomerasen I, II DNA-Topoisomerasen können DNA 1) schneiden 2) drehen3) neu kovalent verknüpfen Dadurch können “Superhelices” aufgelöst oder eingeführt werden! Die Spannung bzw. Überwindung, die durch die Strangtrennung erzeugt wurde, kann wieder entfernt werden. • Topo I : erzeugt vorübergehend ssDNA Brüche • Topo II : erzeugt vorübergehend dsDNA Brüche
• Schema Topo I Kovalente Bindung der DNA- Topo I über Tyr-Rest an DNA Dabei Öffnung einer Phospho- di-Ester-Bindung; die Bindungsenergie bleibt bei der Umesterung auf Tyr erhalten Dadurch können die beiden DNA-Enden relativ zueinander rotieren Durch nochmalige Umesterung wird die Phospho-di-Ester- Bindung in der DNA wieder hergestellt und die DNA-Topo I freigesetzt
• Schema Topo II DNA-Topoisomerase II läuft der Replikationsgabel voraus und entspannt die positiven Überwindungen Dabei setzt sie einen Doppelstrangbruch und schleust den anderen Strang durch die Öffnung, wobei die geschnittenen Enden mit der Topoisomerase verbunden bleiben Danach werden die beiden Enden der Stränge wieder miteinander verbunden
• Wo kommt der RNA-Primer her als Ausgangspunkt der Replikation? DNA-Polymerase: kein de novo-Start möglich!!! ➢ kann nur eine RNA- Polymerase ➢ Primase liefert 3 ́OH Ende für die DNA- Polymerase ➢ bindet an die Helicase und setzt die ersten beiden Primer ➢ dann erst kann die DNA- Polymerase binden und beginnen
• DNA-Polymerase III-Holoenzym 2 DNA-Polymerase III Kernenzyme t-Protein g-Komplex (Klemmenlader) b-Klemme (Sliding-Clamp)
• b-Klemme (Sliding-Clamp) hält die DNA-Polymerase an ihrer Matrize Ohne Klemme: Prozessivität nur 20-100 nt Mit Klemme: Prozessivität 10.000 nt
• g-Komplex (Klemmenlader) Der Klemmenlader lädt unter ATP-Verbrauch die ringförmige Klemme auf die DNA
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• DNA-Polymerase III-Holoenzym Dilemma: Die beiden Kernenzyme müssten in unterschiedlich Richtungen laufen sind aber durch den g-Komplex miteinander verbunden?! ➢  An den ersten beiden Primern wird zunächst eine Klemme geladen und die beiden Holoenzyme- komplexe springen auf ➢  ein Kernenzym polymerisiert zunächst ca. 1000bp des Leitstranges ➢ Damit das Holoenzym bestehen bleibt wird die DNA des Folgestrangs in ein Schleife gelegt und durch das zweite Kernenzym durchgeführt (Posaunenmodell) ➢ Dann setzt die Primase den ersten Primer auf den Folgestrang und das zweite Kernenzym beginnt mit der Synthese des ersten Okazaki-Fragments
• Wie werden die RNA-Primer ersetzt? Prokaryoten: DNA Polymerase I (zusätzlich zur 3 ́-5 ́ Exonulcease-aktivität des proof-readings hat sie eine 5 ́-3 ́ Exonukleaseaktivität ) + Ligase oder RNAse H und Exonuklease + Ligase (oder FLAP Endonulease+ Ligase) Eukaryoten: DNA-Polymerase δ + Ligase oder RNAse H und Exonuklease + Ligase (oder FLAP Endonulease+ Ligase)
• DnaA Erkennung des Origins (Ursprung Replikation)
• DnaC Erkennung des Origins (Ursprung Replikation) Laden der Helicase
• DnaB Helicase entwindet DNA (Primosom)
• DnaG Primase RNA primer Synthese, 6-60 N (Primosom)
• SSB bindet, stabilisiert ssDNA (1-Strang)
• DNA Pol III DNA Synthese (leading und lagging Strang)
• DNA Pol I entfernen den RNA-Primer Reparatursynthese (Auffüllen der Lücken)
• DNA Ligase verschließt Zucker-Phosphat Kette kovalent
• DNA Gyrase Topoisomerase II entspannt DNA supercoiling
• Regulierung der Replikation Prokaryoten über Methylierung (GATC-Motive werden durch die Dam-Methylase erkannt und methyliert) Hemi-Methylierung verhindert eine neue Replikationsinitiation(vorübergehende Bindung von SeqA direkt nach der Replikation, blockiert die Dam-Methylase und damit die Bindung von DnaA an den origin für einige Zeit )
• Wie schnell wird DNA repliziert? Geschwindigkeit der DNA-Polymerase III in Prokaryoten: ca.1000 nt pro Sekunde E.coli Genom:1 ori, Länge in bp: 4,64 x 106 Zeit für eine Replikationsrunde: 4,64 x 103 sec = 77.333 min 2 Replikationsgabeln: 38.66 min
• Wie schnell wird DNA in Eukaryoten repliziert? Geschwindigkeit der DNA-Polymerase d/e in Eukaryoten: ca. 100 nt pro Sekunde Menschliche Genom:1 ori, Länge in bp: 3 x 109 Zeit für eine Replikationsrunde: 3 x 107 sec = 166 666 min= 2777,77 Std= 115,74 Tage 2 Replikationsgabeln: 57,87 Tage???????? Die Rechnung geht wohl kaum auf! Es gibt viele origins verteilt aufmehrere Chromosomen
• Eukaryoten DNA Replikation ist auch bidirektional und hat multiple Origins Jeder eukaryotische ori wird nur einmal während eines Zellzykluses aktiviert, (Steuerung über S-Cycline und cyclin-abhängige Kinasen CDKs)
• Wo endet der Replikation? (Prokayoten) ➢  ringförmiges Genom, ➢  Replikationsblasen laufen aufeinander zu ➢  gegenüber der ori-Sequenz befinden sich Terminationssequenzen ➢  am Ende der Replikation sind 2 ineinander hängende Ringe (Catenane) entstanden ➢  Weitere Funktion der Topoisomerase II am Ende der Replikation: Trennung der beide replizierten Ringe
• Wo endet der Replikation? (Eukayoten) ➢ Lineare Chromosomen, ➢ Replikationsblasen laufen aufeinander zu, ➢ am Ende bleibt eine Lücke ➢ Endreplikationsproblem durch den Mechanismus ➢ Chromosomenverkürzung!!!!
• Replikationsproblem an den Chromosomen-Enden Problem: Nach Entfernung der Primer im Lagging Strang bleibt eine Lücke zurück! Folge: Chromosomen würden bei jeder Replikationsrunde verkürzt!Elizabeth Carrol JackBlackburn Greider Szostak ➢ Findet statt, aber nicht in Stammzellen und Keimbahnzellen! Lösung: Telomerase! Die DNA an den Telomeren besteht aus kurzen Sequenzwiederholungen. Das Enzym „Telomerase“ bringt ein RNA- Template (!) mit, das partiell komplementärist zu Sequenzwiederholungen am 3‘-Einzelstrangüberhang.......... (1) ....dadurch kann die DNA repeat-Struktur im Leitstrang am 3‘ Ende durch die Telomerase verlängert werden....(Polymerisierung an der RNA-Matritze durch Reverse-Transkriptase-Aktivität der Telomerase) (2) .....dann kann wieder ein RNA-Primer am DNA-Leitstrang gebildet werden.... (3) .... an dem dann die Replikation des Folgestrangs erfolgt ......usw.
• Telomerasedefekte Telomerlängen: variabel, beim Menschen bis ca. 10 kbTelomeraseaktivität ist in vielen somatischen Zellen sehr niedrigHohe Telomeraseaktivität in Keimbahn, in Embryonal- und Stammzellen
• Mismatch-Reparatur (MMR) bei E. coli 1)  Erkennung: mismatch wird durch MutS (Klammer) erkannt und gebunden Unter ATP-Verbrauch wird die Klammer einseitg wieder gelöst und MutL und MutHbinden2)  Endonuklease :MutH Bindung spaltet einen Strang, ➢ MutL bindet den methylierten Strang,                                                    ➢ MutH schneidet den unmethylierten Strang 3) Entwindung, DNA-AbbauHelicase II entwindet, 5‘-3‘ Exonuclease VII oder (3‘-5‘ Exonuklease I) entfernt 100-1000 N (1s) upstream (links) oder downstream (rechts)inklusive mismatch 4) Reparatur-Synthese DNA-Pol III synthetisiert neu, Ligase verknüpft kovalent

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