Pflanzenzüchtung (Fach) / Pflanzenzüchtung 5.Semester (Lektion)

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• • Was sind die wesentlichen Ziele und Methoden der Pflanzenzüchtung?  Ziel: Modifikation/Veränderung von Pflanzen um den Bedürfnissen des Menschen besser zu entsprechen   Methoden: Verwendung von existierenden oder neu erzeugten Variationen durch Selektion Entweder durch klassische Züchtung mit natürlich auftretender Variation, die durch Rekombination und Selektion zu eigenen Pflanzenkulturen herangezüchtet werden, oder durch Biotechnologie, die u.a. Zellkultur und Genomik benutzt, um Gene zu transferieren oder die Funktion von Genen herauszufinden, sowie zum Erzeugen von Haploiden durch Protoplastenfusion.
• • Was verstehen Sie unter dem Begriff „Phänotyp“? Wie kommt der Phänotyp zustande (Einflussfaktoren)? Phänotyp ist das Erscheinungsbild eines Individuums, also ein Produkt aus Genotyp und Umwelteinflüssen. Der Genotyp ist dabei die Gesamtheit der genetischen Ausstattung eines Organismus. Die Genotypen können allerdings unterschiedlich gut an verschiedene Umweltbedingungen angepasst sein. Umweltbedingungen setzen sich zusammen aus: Licht, Temperatur, Wasser, Fruchtbarkeit der Erde, Krankheiten, abiotischen Stress usw.
• • Wie unterscheiden sich qualitativ und quantitativ vererbte Merkmale? Nennen Sie je zwei Beispiele aus Kulturpflanzen. Qualitative Variation wird durch nur ein einzelnes Gen beeinflusst, sodass das entsprechende Merkmal entweder vorhanden ist oder nicht (Ja-Nein-Antwort). Beispiele hierfür sind etwa monogenische Resistenzen, Verzwergung, Aluminiumtoleranz, Monogermie, gelbe Samen (bei Raps) oder Gehalt an Erucic Acid. Quantitative Variation geht auf mehrere Gene zurück. Je mehr Gene für ein Merkmal beteiligt sind, desto mehr nähert sich die Verteilung der Ausprägungen des Merkmals an die Normalverteilung an. Es gibt somit eher eine kontinuierliche Abstufung bei der Ausprägung des Merkmals statt den „diskreten Zuständen“ wie bei den qualitativen Merkmalen. Beispiele hierfür sind Ertrag per Hektar, Samengewicht, Ernteindex, Nährstoffaufnahme, Photosyntheserate, Proteingehalt, Verdaulichkeit, Back-/Kochqualität. Geschmack, polygene Resistenzen, Winterhärte und Dürretoleranz.
• • Welche Züchtungskategorien gibt es und wie werden sie unterschieden? ð Klonzüchtung: Durch asexuelle Fortpflanzung (also zum Beispiel durch Knospung bzw. Entstehung von Ablegern, wie bei der Entstehung eines Klons bei der Kartoffel), wobei alle Nachkommen untereinander homogen sind. ð Linienzüchtung: Durch sexuelle Fortpflanzung, allerdings durch Selbstung einer homozygoten Pflanze, sodass alle Nachkommen identisch sind zur Elterngeneration, da nur wiederum homozygote Nachkommen entstehen können.   ð Populationszüchtung: Sexuelle Befruchtung durch Selbstung oder Kreuzbestäubung von anderen Pflanzen. Die Nachkommen unterschieden sich von ihren Eltern, ihre Gene sind heterozygot. Bei einer Population die groß genug ist erhält man jedoch im Durchschnitt bei der Nachkommengeneration dasselbe Ergebnis wie bei der Elterngeneration. ð Hybridzüchtung: Durch gezielte sexuelle Kreuzung von zwei homozygoten Elternpflanzen entstehen lauter identische, heterozygote Nachkommen. Werden diese jedoch untereinander gepaart. Spalten sich die Merkmale (Nach den Mendelschen Regeln) auf, das Ergebnis der ersten Nachkommengeneration ist nicht reproduzierbar.                
• • Wie entsteht genetische Variation und warum ist sie wichtig für die Züchtung? Genetische Variation entsteht durch ð Mutationen: Entstehung von neuen Allelen entweder durch natürliche oder induzierte Mutationen (Induktion von Mutationen z.B. durch Strahlung wie Röntgenstrahlen, Chemikalien wie EMS = Ethymethansulfonat oder in Zellkultur durch somaklonale Variation) ð Rekombination: Neukombination von elterlichen Genen bei der sexuellen Reproduktion sowie durch natürliche oder kontrollierte Kreuzungen, Crossing Over   Wichtig für GWAS ( verschiedene Genome die sich bei verschiedenen Merkmalen aufspalten) Wichtig für neue gene und züchtungen
• • Nennen Sie 3 verschiedene Typen von Kreuzungsnachkommenschaften und erklären Sie, wie diese ausgehend von der Kreuzung zweier homozygoter Elternlinien erstellt werden. ð F2- Nachkommenschaft Nachkommen aus der Selbstbefruchtung einer heterozygoten F1-Pflanze -> nach weiteren selbstbefruchtungen entsteht eine Rekombinante Inzuchtlinie (RIL) ð Doppelhaploide Linien (= DH): Homozygote Linien erhalten aus der Verdoppelung des Genoms von haploiden Gameten wie Eizellen (= Gynogenese) oder Mikrosporen (= Androgenese) ð Rückkreuzungsnachkommenschaft (= Backcross, BC): Rückkreuzung der F1-Generation (heterozygot, homogen) mit einem der Eltern (homozygot) à BC1
• • Wie können doppelhaploide Linien erstellt werden und was ist ihre Besonderheit? Doppelhaploide Linien werden entweder aus den weiblichen Eizellen (= Gynogenese) oder aus den männlichen Mikrosporen (= Androgenese) gewonnen. Androgenese: Aussaat eines Samens, der zur Donorpflanze heranwächst à kurz vor der Blüte werden die Pflanzen kältebehandelt um die Blütenentwicklung zu stoppen à Entfernen der Staubbeutel, die auf Petrischale ausgesät und induziert werden à Entwicklung embryoider Strukturen à Umsetzen der Embryoiden auf regeneratives Medium à Heranwachsen der haploiden Pflänzchen à Verdopplung des haploiden Genoms durch Behandlung mit Colchicin (Verhindert Teilung der Chromosomen während der Mitose) à Pflanze mit zwei mal dem gleichen Chromosomensatz (= doppelt haploid) Gynogenese: Entfernen der eigenen Staubbeutel à Bestäubung der Pflanze mit Maispollen (Auslösen des Befruchtungsreizes aber nachher Eliminierung der Mais-DNA) à Behandlung mit Wachstumsfaktoren à Entnahme der haploiden Embryos aus Samen (ohne Endosperm => Embryo würde verhungern) à im Dunkeln auf regenerativem Medium kultivieren à bei Licht zu Pflänzchen heranziehen à durch Colchicinbehandlung Verdoppelung des haploiden Genoms
• • Was sind molekulare Marker und welche Voraussetzungen müssen sie erfüllen? Allgemeine Defintion: Molekulare Marker sind DNA-Sequenzen die mit passenden Methoden detektiert werden können. Ein Marker ist ein DNA-Segment mit einer feststellbaren physikalischen Lage auf einem Chromosom, dessen Vererbung verfolgt werden kann. Ein Marker kann ein Gen sein oder ein Stück DNA ohne bekannte Funktion. DNA-Segmente die auf einem Chromosom nahe beieinander liegen werden zusammen vererbt. Deshalb werden Marker benutzt werden, um die Vererbungsmuster von Genen zu bestimmen, die noch nicht identifiziert wurden aber deren ungefähre Lage bekannt ist. Voraussetzungen hierfür sind, dass der Marker polymorph ist, das Experiment reproduzierbar und transferierbar ist. Marker müssen gleichmäßig über das Genom verteilt sein, codominant vererbt werden und schnell, einfach und billig zu detektieren sein.
• • Nennen Sie wichtige Einsatzbereiche für molekulare Marker. ð Zur Detektion von Unterschieden zwischen Individuen (also zur Unterscheidung von unterschiedlichen Varianten einer Erntespezies oder um Ähnlichkeiten zwischen verschiedenen Spezies zu finden) ð Verfolgen der Vererbung eines molekularen Markers in einer sich aufspaltenden Population (also um eine Kopplung mit einer bestimmten Eigenschaft wie Resistenzgenen herauszufinden oder als Marker um ein bestimmtes Gen zu selektieren à Markergestützte Selektion) ð Verwendung von mehreren/vielen Markern um eine Kopplungskarte herzustellen (für Genomanalyse oder kartenbasiertes Klonieren)
• • Beschreiben Sie in kurzen Schritten das Funktionsprinzip von RFLP / SSR -Markern. Erklären Sie, wie Polymorphismen bei diesen Markertechniken zustande kommen. RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphisms Genomische DNA wird durch Restriktionsenzyme verdaut à Gelelektrophorese trennt die Fragmente entsprechend ihrer Größe auf à Übertragen der Fragmente von dem Elektrophoresegel auf eine Membran (dabei Denaturierung in basischem Puffer à Einzelsträngige DNA-Sonde wird gelabelt (radioaktiv oder mit Biotin) à gelabelte Einzelstrang-Sonde hybridisiert mit homologen Sequenzen à Detektion via Autoradiographie oder Chemilumineszenz Verwendung von homologen Sonden (aus dem gleichen Organismus) oder heterologen Sonden (aus einem verwandten Organismus) ist möglich. Der Erflog der Hybridisierung ist abhängig von der Sequenzidentität zwischen Sonde und Marker ( > 70%). Codominant vererbte Polymorphismen entstehen durch Hinzukommen oder Verlust von Restriktionsschnittstellen (z.B. durch Punktmutationen) oder durch Insertionen oder Deletionen zwischen zwei Restriktionschnittstellen. Selten entstehen auch dominant vererbte Polymorphismen durch größere Insertionen und Deletionen. Bei dominanter Vererbung können, falls ein Elter die gleichen Banden wie die F1-Generation aufweist, heterozygote Pflanzen von diesem Elter nicht mehr unterschieden werden.   SSR = Simple Sequence Repeats SSR-Motive bestehen aus 1-5 Basenpaaren die 5-30mal wiederholt werden (= Microsatellit oder STR = Short Tandem Repeat) Genomische DNA wird isoliert, mit Restriktionsenzymen verdaut und in Phagen oder Plasmide kloniert. Die Klonbibliothek wird durch Mikrosatellit-Motive durchsucht, positive Klone werden sequenziert. Spezifische Primer von ca. 20 bp für die Sequenzen die rechts und links von den Repeats liegen werden entwickelt und mittels PCR vervielfältigt. Dieser Prozess kann bei bekannten Genomen auch durch Datenbanksuchen in ESTs (= Expressed Sequence Tags, partiell oder komplett sequenzierte cDNA-Abschriften der mRNA einer Zelle) oder genomischer DNA nach solchen Repeats ersetzt werden. Es werden die Fragmente (ca. 100-300 bp lang) per PCR amplifiziert, die die Repeats enthalten und anschließend durch SDS-PAGE oder hochauflösende Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Die Banden werden sichtbar gemacht durch fluoreszenzgelabelte Primer, Silberfärbung, Radioaktivität oder Ethidiumbromid. Codominant vererbte Polymorphismen entstehen durch eine variable Anzahl an Repeats, dominant vererbte eher selten durch den Verlust der Primer-Bindestelle.
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• • Was sind SNPs und wie kommen sie zustande? Welche Auswirkungen haben SNPs in unterschiedlichen Teilen des Genoms? SNP = Single Nucleotide Polymorphism SNPs sind Positionen, an denen sich die Genome von einzelnen Individuen in einer Base unterscheiden (= Punktmutationen). SNPs zeigen eine Kopplung mit der DNA, die sie umgibt, sodass ein bestimmtes SNP normalerweise in Kombination mit bestimmten Allelen für benachbarte Gene auftritt. Diese Kopplung erzeugt Haplotypen, bei denen das Auftreten eines Gens vorhergesagt werden kann durch das Vorhandensein gekoppelter SNPs. Diese Kopplung kann durch Crossing Over aufgehoben werden. Je weiter die SNP-Marker von den entsprechenden Genen entfernt liegen, desto wahrscheinlicher wird ein Crossing Over zwischen den Positionen, sodass diese Kopplung nur für benachbarte Abschnitte der DNA angenommen werden kann. SNPs können auftreten in folgenden Formen: * rSNPs: in regulatorischen Regionen (haben möglicherweise einen Einfluss auf den Phänotyp, wenn dadurch die Regulation eines Gens beeinflusst wird) * iSNPs: in Introns gelegen (haben möglicherweise einen Einfluss auf den Phänotyp, wenn zum Beispiel die für das Splicing nötigen konservierten Positionen betroffen sind) * cSNPs: in Exons (haben einen Einfluss auf den Phänotyp, wenn sie nicht synonym sind und dadurch für eine andere Aminosäure codieren) * sSNPs: in Exons (haben keinen Einfluss auf den Phänotyp, obwohl sie in Exons liegen, weil sie synonym sind und deshalb keine Aminosäure-Substitution nach sich ziehen) * gSNPs: in genomischen, nicht codierenden Sequenzen (haben keinen Einfluss auf den Phänotyp)
• • Nennen Sie Methoden zum Auffinden von neuen SNPs bzw. zur Detektion von bereits bekannten SNPs und erklären Sie die Methoden kurz. Singe Base Extension Assay: Hierbei handelt es sich um eine allelspezifische PCR, wobei der Primer komplementär ist zu der Sequenz direkt upstream von dem zu untersuchenden SNP, und das 3’-Ende des Primers hört genau eine Position vor dem SNP auf. Die Primer sind durch unspezifische Anhängsel unterschiedlich lang, enthalten jedoch stets eine 18-28 bp lange Sequenz die komplementär ist zur Target-DNA. Die Target-DNA wird zuerst mittels PCR amplifiziert, dann werden die jeweiligen Primer zugegeben. Das 3’-Ende des Primers wird von einer Polymerase um genau ein Abbruchnucleotid erweitert, welches ein Fluoreszentlabel trägt und komplementär ist zu der jeweiligen Base des SNP. Die Farbe des Fluoreszenzlabels gibt dann an, welche der vier Basen an dieser SNP-Position vorhanden ist. Durch unterschiedlich lange unspezifische Anhängsel an verschiedene spezifische Primer können auch Multiplex-Bestimmungen mehrerer SNPs durchgeführt werden, indem die Primer dann der Länge nach aufgetrennt werden. Aufgrund des Längenunterschieds lassen sich die fluoreszierenden Abbruchnucleotide ihrer jeweiligen Position zuordnen.   TaqMan 5’-Nuclease Assay: Die Sequenz, die das SNP enthält, muss hierfür bekannt sein. Zu der Target-DNA wird eine TaqMan-Sonde hinzu gegeben, die komplementär ist zu der Sequenz, die das SNP umgibt, und die an einem Ende einen Reporter-Fluoreszenzfarbstoff und an der anderen Seite einen Quencher trägt. Diese Sonde kann an ihre Zielsequenz binden, wenn die darin enthaltene Base an der SNP-Position komplementär zu der in der Target-DNA ist, bei einem Mismatch bindet die Sonde nicht stark genug. Außerdem werden zwei PCR-Primer jeweils in einigem Abstand up- und downstream von der TaqMan-Sonde benötigt. Während der PCR hybridisiert die TaqMan-Sonde also mit der zu ihr komplementären Sequenz innerhalb des PCR-Targets. Während der PCR wird die Sonde aber durch die 5’à3’-Exonucleaseaktivität der Taq Polymerase abgebaut, wodurch der Reporterfarbstoff und der Quencher räumlich getrennt werden. Dadurch wird der Einfluss des Quenchers auf den Reporter verringert, und die Intensität der Fluoreszenz nimmt exponentiell zu. Die Lichtemission wird mittels eines Spektrometers am Ende der PCR bestimmt. Diese Methode benötigt keine Gelelektrophorese und ermöglicht die Real-Time-Detektion. Bei Verwendung unterschiedlicher Fluoreszenzreporter für verschiedene Sonden kann zum Beispiel auch die Heterozygotie bezüglich eines SNP nachgewiesen werden.     High Throughput Detection: Illumina Golden Gate Assay: Die genomische DNA wird fragmentiert und über eine Bindung an Biotin aufgereinigt. Zur Target-DNA werden allelspezifische Primer gegeben, die als letzte Base die jeweilige Base des SNP haben, sowie locusspezifische Primer, die als reverse-Primer dienen und zudem eine Adresse, also eine bestimmte Sequenz an der sie erkannt werden können, tragen. Das Stück Target-DNA wird in einer PCR amplifiziert, wenn der jeweils allelspezifische Primer daran bindet. Die genetische DNA wird über das daran gekoppelte Biotin entfernt, die durch PCR entstandenen Produkte werden durch universelle Primer in einer PCR amplifiziert. Dabei wird mittels der Sequenz des allelspezifischen Primers ein Floureszenzlabel angebracht. Die PCR-Produkte können dann über ihre Adresse mit dem dazu komlementären Oligonucleotid hybridisieren, die an einem Kügelchen (=Bead) immobilisiert sind. Anhand der Adresse, die auf dem Bead war, kann der SNP dann einer Position im Genom zugeordnet werden, und die Farbe bzw. deren Mischung gibt an, ob das untersuchte Genom für dieses SNP homo- oder heterozygot ist.   High Throughput Detection: Illumina Infinium II Assay: Die zu untersuchenden DNA-Fragmente werden amplifiziert, gefällt und resuspendiert. Anschließend werden die Fragmente auf ein Array aufgetragen, welches Beads enthält, die Oligonucleotide tragen, welche spezifisch komplementär zu der Sequenz vor dem SNP sind. Diese Oligonucleotide an den Beads werden dann mit der Target-DNA als Template um genau ein Abbruchnucleotid verlängert, welches komplementär zu dem SNP ist und ein Fluoreszenzlabel trägt. Die Base des SNPs an dieser Position ist also anhand der Floureszenzfarbe des entsprechenden Beads zu erkennen. Für diesen Assay wird die vollständige genomische DNA ohne PCR sondern durch isothermale Amplifikation (Rolling Circle) vervielfältigt, die Fragmente werden durch Restriktionsendunucleasen erzeugt. Die Alleldetektion erfolgt in zwei Schritten. Zuerst werden die DNA-Fragmente selektiv an die Beads gebunden, indem sie mit den locusspezifischen, 50 bp langen Oligonucleotiden auf den Beads hybridisieren. Für jeden SNP wird ein Bead benötigt. Die Allelspezifität ist dann gegeben durch die Verlängerung des Oligonucleotids auf dem Bead um eine Base, die Extensionsreaktion wird unterdrückt durch Verwendung von ddNTPs. Die Basen werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern gelabelt, sodass aufgrund der Farbe bzw. die Mischung der Farben bestimmt werden kann, welches Allel entweder homo- oder heterozygot vorliegt.
• • Welche Kriterien sind entscheidend bei der Auswahl einer geeigneten SNP Genotypisierungsplattform? Die Wahl der Methode ist abhängig von den technischen Ressourcen sowie die Zugänglichkeit der technischen Plattformen, die Verfügbarkeit von Markern (wie viele sind überhaupt bekannt), die Anzahl der Genotypen und die Anzahl der Marker (evtl. High Throughput nötig) sowie die Kosten des Verfahrens. Außerdem werden seit neuestem immer mehr direkte Resequenzierungen mit next-generation Sequenztechniken verschiedener Genotypen durchgeführt.
• • Was versteht man unter dem Begriff „Rekombination“? Wie ist „Rekombinationsfrequenz“ definiert? (genetische) Rekombination = der Prozess, bei dem ein Nukleinsäurepolymer aufgebrochen und mit einem anderen wieder verbunden wird. Dies erfolgt durch Crossing Over, der Überkreuzung von zwei Nichtschwester-Chromatiden an äquivalenten Positionen. Es erfolgt ein Doppelstrangbruch und die Teilstücke der Chromatiden werden mit dem jeweils anderen Chromatiden verknüpft, sodass Äquivalente Portionen zwischen den Chromatiden ausgetauscht werden. Die Rekombinationsfrequenz gibt an, wie oft ein Crossing Over zwischen zwei Markern vorkommt. Hierfür wird untersucht, wie viele Nachkommen einer Rückkreuzung der heterogygoten F1-Generation mit dem homozygot rezessiven Elter parentale bzw. rekombinante Kombinationen aufweisen. Die Rekombinationsfreuenz Theta ϴ = Anzahl der rekombinanten Nachkommen / Gesamtzahl der Nachkommen
• • Was wird für die Erstellung einer genetischen Kopplungskarte benötigt? Nennen Sie die wesentlichen Schritte bei der Analyse molekularer Markerdaten zur Erstellung von Kopplungskarten in spaltenden Nachkommenschaften. Analyse der Qualität des Einzellocus-Modells mit dem Goodness of Fit Test: Untersuchung der Markerqualität für einen einzelnen Locus um zu sehen, ob er wie erwartet vererbt wird Analyse von Modellen mit zwei Loci zur Detektion der Kopplung und Abschätzung des Anteil mit Rekombination: Genetische Kopplung bedeutet, dass Gene auf einem Chromosom gekoppelt vererbt werden. Diese Kopplung kann durch Crossing Over, das zwischen den Genen stattfindet, aufgehoben werden. Um festzustellen, ob eine Kopplung vorliegt oder die Marker unabhängig voneinander vererbt werden, wird wieder der Chi-Quadrat-Test angewendet.  Anordnen der gekoppelten Marker in Gruppen: Die Loci werde in Kopplungsgruppen aufgeteilt, wobei in einer Gruppe all die Loci zusammengefasst werden, die eine Kopplung miteinander aufweisen. Diese Marker liegen zusammen auf einem Chromosom. Die Gruppen können durch statistische Kriterien (z.B. Rekombinationsfrequenz zwischen den Markern) oder biologischen Kriterien (z.B. Anzahl der Chromosomen) zusammengestellt werden.  Der Reihe nach Anordnen der gekoppelten Marker: Die lineare Anordnung der Loci beruht auf deren genetischen Abstand, der aufgrund der Rekombinationsfrequenz berechnet werden kann. Meist werden dabei auch doppelte Crossing Overs und die Interferenz beachtet, welche doppelte Crossing Over an manchen Positionen verhindert. Die Anordnung der Loci beruht zum Beispiel auf dem Prinzip der größten Wahrscheinlichkeit oder sucht nach der geringsten Chromosomenlänge und der geringsten Anzahl von Crossing Overs.  Multi-Point Analyse
• • Was sind Kartendistanzen („mapdistances“) und welche Eigenschaften haben sie? Warum wurden diese eingeführt? Die Kartendistanzen werden gemessen in centiMorgan. Sie wurden eingeführt, weil die Rekombinationsfrequenzen sich nicht additiv verhalten, da doppelte Crossing Overs umso wahrscheinlicher werden, je weiter zwei Loci auseinander liegen, und dadurch trotz der Rekombination für diese beiden Loci die parentale Kombination vorliegt.
• • Wozu wird der „GoodnessofFit“ Test bei der genetischen Kartierung eingesetzt? Formulieren Sie anhand eines Beispiels für einen Einzelmarker bzw. ein Markerpaardie jeweilige Nullhypothese, und prüfen Sie durch Berechnung des chi2-Werts, ob diese Nullhypothese angenommen oder abgelehnt wird. Der Goodness of Fit Test untersucht, ob sich das beobachtete Aufspaltungsverhältnis signifikant von dem erwarteten Verhältnis unterschiedet, und damit ob sich ein Locus als Marker eignet, weil er entsprechend den Erwartungen vererbt wird. Er untersucht die Markerqualität für einen einzelnen Locus.   X2 = Summe (O-E)2 /E                  (Chi quadrat)        Observer : O           Expected: E (NUllhypothese)           Nullhypothese: Fα 1:2:1 (co-dominant) / 3:1 (dominant) DH/RI/BC 1:1 Phenotyp / E / O/ X2 A/ 27.5/25/0.227 H/55.0/59/0.291 B/27.5/26/0.082 Insgesamt X2 = 0.600 X20.05,2df = 5.99 Chi-quadrat verteilung  X2 angenomen da 0.600 kleiner 5.99
• • Warum sind genetische Distanzen in einer Kopplungskarte nicht gleichzusetzen mit physischen Abständen? Welche Faktoren spielen eine Rolle? Genetische Distanzen sind abhängig von der Rekombinationswahrscheinlichkeit. Die Wahrscheinlichkeit eines Crossing Overs ist allerdings nicht überall auf dem Chromosom konstant: An den Enden finden Rekombinationen viel öfter statt als am Centromer. Da genetische Distanzen gemessen werden an der Häufigkeit, mit der eine Rekombination zwischen zwei Loci stattfindet, ist der genetische Abstand abhängig von der Crossing Over-Wahrscheinlichkeit. Die physikalischen Abstände geben den Abstand der Loci absolut in Basenpaaren an, unbeeinflusst von der Wahrscheinlichkeit, dass zwischen den Loci ein Crossing Over stattfindet. Die Wahrscheinlichkeit der Rekombination ist abhängig vom Geschlecht, dem Individuum (genetischen Faktoren), dem Chromosom sowie der Position auf dem Chromosom, der Temperatur und weitere Umweltfaktoren
• • Wie kommt quantitative Variation für ein Merkmal zustande? Wodurch wird diese beeinflusst? Quantitative Variation eines Merkmals tritt dann auf, wenn dieses Merkmal durch mehr als nur ein Gen beeinflusst wird. Wird also von den zahlreichen Genen, die jeweils einen kleinen Effekt auf das Merkmal haben, jedes einzelne nach den Mendel’schen Regeln vererbt, so erhalten die Nachkommen viele unterschiedliche Kombinationen dieser Gene und zeigen somit viele unterschiedliche Phänotypen, deren Unterschiede untereinander allerdings nur recht klein sind wenn sich nur wenige Gene unterschieden und mit der Anzahl der sich unterscheidenden Gene durch deren kumulativen Effekt zunehmen. Des Weiteren spielen hier auch Interaktionen zwischen Genen eine Rolle. Der Einfluss des Genotyps formt dann zusammen mit den Einflüssen der Umwelt den jeweiligen Phänotyp.
• • Was sind die Ziele von QTL-Kartierungsstudien? Diese Studien wollen herausfinden, wie viele Gene ein Merkmal beeinflussen und wo diese Gene auf dem Genom liegen. Ihr Effekt und ihre Vererbung sollen bestimmt werden und ihre Funktion verstanden werden. Wenn all diese Dinge bekannt sind, kann man die QTL klonen und auf sie selektieren.
• • Erklären Sie das Prinzip der QTL-Kartierung mit Introgressionsbibliotheken. Für welche Situationen eignen sich Introgressionsbibliotheken besonders gut (und warum)? -Individuelle Gene werden getrennt, der effekt auf das Merkmal kann besser beobachtet werden   Nachkommen von Kreuzungen mit WT/ nicht eltitäre linien sind oft weniger vital, haben geringe Leistung, IL sind kräftiger und haben ungewollte Eigenschaften nicht eltärer linien verloren
• • Welche Parameter beeinflussen die Ergebnisse bei der Kartierung von QTL? Die QTL-Kartierung wird beeinflusst von der Anzahl der untersuchten Proben, der Anzahl der betrachteten Umwelten und der Signifikanzgrenze. Diese Parameter beeinflussen sowohl die Macht des Tests für die Detektion von QTL als auch die Genauigkeit und Präzision der QTL-Parameter und die Lokalisierung der QTL. Je mehr Stichproben und Umwelten betrachtet werden und je höher die Signifikanzgrenze gewählt wird, desto größer ist die Anzahl von echten QTL die detektiert werden und die Anzahl der falsch Positiven und der falsch Negativen nimmt ab.
• • Wie gehen Sie vor, wenn Sie ein qualitatives Merkmal (z.B. monogene Resistenz) kartieren wollen? Anfangs wird eine spaltende Kreuzung bezüglich dieses Zielgens durchgeführt. Dabei wird ein jeweils homozygoter Elter der das Zielgen in der gewünschten Ausführung besitzt mit einem homozygoten Elter gekreuzt, der es in einer anderen Ausführung besitzt. Die entstehende F1-Generation ist dann heterozygot für dieses Merkmal. Damit soll ein Marker gefunden werden, der mit dem Zielgen koppelt. Hierfür gibt es drei verschiedene Methoden: a) Erstellen einer Kopplungskarte des gesamten Genoms (hierfür wird eine große Anzahl Marker und eine Analyse der gesamten Population benötigt) b) Entwicklung nah-isogener Linien durch wiederholte Rückkreuzung (sehr zeitaufwändig) c) Bulked Segregant Analysis (relativ schnell, man muss nicht die ganze Population mit allen Markern untersuchen)
• • Was sind nah-isogeneLinien? Wie werden diese erzeugt? Wozu können nah-isogeneLinien verwendet werden? Nah-isogene Linien sind Linien, die sich auf ihrem ganzen Genom nur in der Umgebung eines einzelnen Zielgens unterschieden. Sie werden erzeugt aus einem Donor- und einem Rezipientenstamm. Der Donorstamm liefert dabei das Zielgen, der Rezipientenstamm den Rest der DNA. Die beiden Stämme werden spaltend gekreuzt aus jeweils homozygoten Eltern. Die heterozygoten Nachkommen werden rückgekreuzt mit dem homozygoten Rezipientenelter. Bei der Kreuzung findet Crossing Over statt, sodass ein Teil der Donor-DNA durch Rezipienten-DNA ersetzt wird. Die nachfolgenden Generationen aus weiteren solchen Kreuzungen mit dem Rezipientenelter werden dann auf das gewünschte Zielgen selektiert und immer wieder rückgekreuzt. So entsteht mit der Zeit eine Linie, die das Zielgen des Donorstamms im restlichen Genom des Rezipientenstamms trägt. Nah-isogene Linien können verwendet werden, um Marker in der Nähe des Zielgens zu identifizieren. Dabei werden Marker auf dem gesamten Genom untersucht. Da sich die Genome außer in der Umgebung des Zielgens jedoch nicht vom Rezipientenstamm unterscheiden, weisen nur solche Marker einen Polymorphismus auf, die zusammen mit dem Zielgen übertragen wurden und somit mit dem Zielgen eng koppeln. NILs werden auch erzeugt bei der Einführung eines Zielgens in einen anderen genetischen Hintergrund.
• • Erklären Sie das Prinzip der „BulkedSegregantAnalyse“. Welche Vorteile bietet diese Methode? In der Bulked Segregant Analysis werden wieder zwei homozygote Eltern gekreuzt. Die aufspaltende Nachkommenschaft wird eingeteilt in Gruppen (=Bulks), die durch die jeweiligen Phänotypen ausgezeichnet sind (z.B. resistent – anfällig). Anschließend wird sowohl die DNA der Eltern als auch die DNA der Bulks isoliert und die Marker verglichen. Durch das poolen der Genotypen in Bulks werden eine Art „künstliche NILs“ erzeugt. Diese unterscheiden sich auf Grund von Crossing Overs während der Fortpflanzung und sind somit im Durchschnitt heterozygot. Lediglich die Gruppe, die den rezessiven Phänotyp aufweist, ist an der Stelle des Zielgens homozygot rezessiv. Das Zielgen koppelt also mit solchen Markern, die in den Eltern und der rezessiven Variante jeweils homozygot vorliegen, in der Gruppe mit dem dominanten Phänotyp jedoch heterozygot sind. Trifft diese Aufteilung nicht zu, dann koppeln die Marker mit dem Zielgen nicht. Diese Methode bietet den Vorteil, dass dabei nur die Marker in allen Individuen der Population kartiert werden müssen, die mit dem Zielgen koppeln.
• • Erklären Sie die Begriffe „foregroundselection“ und „backgroundselection“. Welche Ziele werden mit diesen beiden Ansätzen verfolgt? Foreground Selection:  benutzt Marker um ein Zielallel zu selektieren, dessen direkte Selektion über den Phänotyp schwer ist (z.B. rezessive Allele oder QTL Allele). Diese Marker werden auch dazu benutzt, ein Transgen in einen anderen genetischen Hintergrund (andere Pflanze, von einer Donorlinie zu einer Rezipientenlinie) zu transferieren. Dafür werden Donor- und Rezipientenstamm (jeweils homozygot) gekreuzt. Bei der Selbstung der F1-Generation entstehen auch Crossing Overs, sodass die entstehenden Nachkommen teilweise das Zielgen mit den flankierenden Markern auf Chromosomen haben, die Abschnitte von beiden Linien haben. Durch wiederholte Rückkreuzung sowie Selektion auf die flankierenden Marker entstehen Nachkommen, die das Zielgen tragen aber deren Genom gleichzeitig größtenteils dem der Rezipientenlinie entspricht. Durch Selbstung oder der Erzeugung von Doppelt Haploiden eines solchen Nachkommen gelangt man zu homozygoten Trägern des Zielgens. Background Selection: benutzt Marker um den Anteil des Donorgenoms zu minimieren. Dadurch wird der Linkage Drag (= mitziehen von Genen die benachbart zum Zielgen sind) sowie die nötige Populationsgröße reduziert. Außerdem soll vor allem der Anteil des Donorgenoms an den Non-Carrier-Chromosomen (die nicht das Zielgen tragen) minimiert werden, was gleichzeitig eine kleinere Populationsgröße und eine geringere Anzahl an zu untersuchenden Markern zulässt. Die verwendeten Marker werden dafür genutzt, auf einen möglichst großen Anteil von Rezipientengenom zu selektieren. Alternativ ist gleichzeitig eine wiederholte Rückkreuzung mit einer Selektion auf die Foreground-Marker möglich, sodass das eingeführte Gen nicht verloren geht. Die Background Selection kann in zwei, drei oder vier Schritten erfolgen: Zweischritt-Verfahren: zuerst wird auf das Vorhandensein des Zielallels selektiert, anschließend auf ein Individuum das für eine möglichst große Anzahl von Rezipientenmarkern homozygot ist. Dreischritt-Verfahren: Zuerst wird auf das Vorhandensein des Zielallels selektiert, dann werden Individuen gesucht, die homozygot für die Rezipientenallele sind, die das Zielgen flankieren und anschließend wird daraus ein Individuum gewählt, das für eine möglichst große Anzahl von Rezipientenmarkern homozygot ist. Vierschritt-Verfahren: Zuerst wird auf das Vorhandensein des Zielallels selektiert, dann werden Individuen gesucht, die homozygot für die Rezipientenallele sind, die das Zielgen flankieren. Anschließend wird darauf selektiert, dass alle Marker auf dem Carrier-Chromosom homozygot das Rezipientenallel tragen und anschließend wird daraus ein Individuum gewählt, das für eine möglichst große Anzahl von Rezipientenmarkern auf allen Chromosomen homozygot ist. Eine höhere Anzahl an Schritten reduziert die Anzahl der Rückkreuzungsgenerationen und damit auch die anfallende Datenmenge in jedem einzelnen Schritt.
• • Welche Voraussetzungen müssen Marker für die „foregroundselection“ erfüllen? Die Marker müssen mit dem jeweiligen Zielgen eng koppeln und einen Polymorphismus zwischen Rezipienten und Donor aufweisen.
• • Welche Kriterien sind relevant für die Selektion eines qualitativ vererbten Merkmals mit Hilfe von molekularen Markern im Rahmen der marker-gestützten Selektion? Der verwendete Marker muss mit dem QTL (= quantitativ vererbtes Merkmal) eng koppeln, das heißt Crossing Overs dazwischen dürfen nicht/nur höchst selten auftreten. Der diagnostische Wert des Markers muss bestätigt sein für den jeweiligen genetischen Hintergrund, das heißt ob der Marker und der entsprechende QTL in der gegebenen Population wirklich verlässlich in der jeweiligen Kombination koppeln. (In einer Population zum Beispiel könnte der Marker m mit dem QTL q koppeln und M mit Q, in einer anderen koppelt m mit Q und M mit q.) Die markergestützte Selektion wird nur eingesetzt, wenn sie kosteneffizienter, präziser oder weniger zeitaufwändig ist als die Selektion nach Phänotypen.
• • Wie kommt quantitative Variation für ein Merkmal zustande? Wodurch wird diese beeinflusst? Gene pool concept   For the moment, we do not look at biparental experimental populations, but at natural populations. The total sum of all alleles in the breeding members of a population at a given time determine the genetic variation of this population. This variation can be described by genotype and allele frequencies.
• • Worauf basieren GWAS-Studien? Wodurch unterscheiden sie sich von der QTL-Kartierung in biparentalen Populationen? linkage analysis and  association studies rely on co-inheritance of functional polymorphisms and neighboring DNA variants Only two alleles (biparental population)Only few recombination eventsLow mapping resolutionLow to intermediate marker density sufficient   Multiple alleles (natural diversity) Historical recombination events High mapping resolution Very high marker density needed  
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• • Was ist des Prinzip des Hardy-Weinberg Gleichgewichts? Auf welchen Annahmen beruht es? Mathematisches Modell Eine nur von der Allelfrequenz abhängige Genotyp Verteilung der erst Nachkommen  à ändert sich nicht in folgender Generation Annahme: -keine selektion, keine migration, keine mutation
• • Was ist das Kopplungsphasenungleichgewicht (LD)? Worauf beruht es? LD between two loci is the difference (D) between the observed frequency of a haplotype and the expected frequency given a random association among alleles at the two loci      Linkage disequilibrium (D) is the difference in the product of frequencies between parental (r, u) and recombined (s, t) gametes
• • Was versteht man unter „Forward Genetics“ und „Reverse Genetics“? Phenotype (mutant) is known, but causative gene is not knownà Forward genetics
• • Welche Schritte sind erforderlich bei der kartengestützten Klonierung eines Gens (Unterschiede monogene Merkmale / QTL)? Was sind die Voraussetzungen, welche molekularen/biologischen Ressourcen müssen geschaffen werden, wie ist die Vorgehensweise? Phenotyp-> Map position (genetic map) -> 1. -> über genetic finemapping über höhere resolution und gen finden) -> phenotypen angeschaut 2.-> umwandlung zu Map position on physical map (gen gefunden muss nurnoch isoliert und sequenziert werden. -> Gen -> sequenzieren zb. Über BACs  und function bestimmen
• • Was versteht man unter „chromosome walking“? Welches sind die wichtigen Kriterien für erfolgreiches chromosome walking? 1.     M1 und M2 verwenden um BAC bibliothek zu screenen -> finden ein Bac welches Abschnitt mit Markern enthält 2.     Sequencieren des Endes des gefundenen BACs 3.     Die BAC end sequenz benutzen um weitere BAC clone zu finden die (physische) lücke zwischen M1 und M2 schließen 4.     2 und 3 wiederholen bis keine lücke mehr vorhanden ist -> minimal tilling path-> viele BACs sequenziert   Es werden laufend neue marker gefunden die näher an unser target gen kommen -> walking   Bacs mit ursprungsprobe I gefunden -> eingereiht -> I2 und I1 neue Marker -> dabei sind diese die Bordersequenzen der BACs
• • Mit welchem Ansatz kann nachgewiesen werden, dass ein über kartengestützte Klonierung identifiziertes Kandidatengen tatsächlich ursächlich für den beobachteten Phänotyp (z.B. Virusresistenz) ist? Welche Strategien müssen bei dominanten / rezessiven Genen berücksichtigt werden? Proof of function through complementation Bsp. Rym5 (a recessive resistance gene) Transfer candidate gene (susceptibility allele) in resistant plants Transformed plants are susceptible (alternative: generate knock out eg by crispr)
• • Was ist Syntänie? Wie kann sie bei der Klonierung von Genen genutzt werden? Synteny: Similarity in content and organization between chromosomes of different species, implies: • if a gene is localized in one species with respect to markers • and the markers are shared by the other species, • there is high probability that the respective gene is found in vicinity of these markers in the second species.
• • Nennen Sie zwei Ansätze zur insertionellen Mutagenese. Welche Effekte werden damit erzielt? Transposons T-DANN Knock out mutanten werden generiert indem Gene durch insertion eines DANN Fragments ausgeschaltet werden.   Insertion direkt in Gen-> ausgeschaltet Insertion in Promotorregion->unter oder überexpression des davon regulierten Gens
• • Welche beiden Klassen von Transposons gibt es und wodurch unterscheiden sie sich im Wesentlichen? Class I (retrotransposons): transposition via RNA intermediate à “copy and paste” Class II (transposons): transposition via DNA intermediate à “cut and paste
• • Welche Effekte kann das Springen von Transposons im Genom zur Folge haben? Nicht funktionelles protein Transcription in anderen zelltypen aktiviert Kein effekt
• • Welche Einschränkungen gibt es bei Knock-out Mutanten? Welche Alternativen gibt es? Bei knock-out mancher Gene ist manchmal kein entsprechender phänotyp zu beobachten da Gen dubliziert vorliegt (kompensation) Existenz alternativer stioffwechselwege oder regulatorischer netzwerke Letalität Dominante mutation in erster generation gezeigt, rezessive nicht-> muss homozygot sein Alternativen: Activation tagging Promoter/enhancer trapping
• • Was sind die Ziele und welche Voraussetzungen sind für Reverse Genetics Ansätze erforderlich? Das Ziel der reversen Genetik ist es, bereits bekannten Genen eine Funktion zuordnen. Dies wird möglich durch die Sequenzierung diverser Genome, sodass viele Gene ohne bekannte biologische Funktion identifiziert werden konnten. Von diesen Genen soll durch die reverse Genetik in der post-Sequencing Era die Funktion ermittelt werden. Die Voraussetzung dafür ist, dass die Genomsequenz vollständig oder zumindest teilweise bekannt ist. Hierfür sind zum Beispiel Sequenzentwürfe oder EST-Sequenzen verwendbar.
• • Nennen Sie drei Methoden für genomweite Mutagenese und erläutern Sie diese. Die genomweite Mutagenese kann erfolgen durch insertionelle Mutagenese, Schnelle Neutronen-Mutagenese oder TILLING.   Insertionelle Mutagenese: Diese Methode greift zurück auf T-DNA-Insertionen oder transposable Elemente (wie zum Beispiel Ac/Ds, En/Spm oder Tos17). Es lassen sich Knock-out Mutanten erzeugen, durch Promotor- oder Enhancer-Trapping die Expression eines Gens vermindern oder durch Activation Tagging eine vermehrte Expression erreichen. Hierfür wird eine Insertionslibrary erstellt, indem ein Fragment bekannter Sequenz (z.B. T-DNA oder ein Transposon) in eine große Menge Pflanzensamen eingebracht wird. Es werden Proben der ausgewachsenen Pflanzen genommen und entweder zu 2D oder 3D DNA-Pools zusammengefasst. Der Nachweis der Insertion in das gewünschte Gen wird durch PCR nachgewiesen. Dafür werden Primer dazugegeben, die von den Enden der Gensequenzen nach innen zeigen und welche, die von der bekannten Insertionssequenz nach außen zeigen. Wenn das zu untersuchende Gen keine Insertion trägt, entsteht ein langes Fragment bei der PCR, ist das Insert jedoch enthalten dann entstehen zwei kurze Fragmente. Mit dieser Methode werden die DNA-Pools gescreent. Die Individuen in einem positiven Subpool werden dann untersucht und solche Pflanzen ausgewählt und identifiziert. Aus diesen Pflanzen wird dann durch Selbstung eine Mutantenlinie erzeugt, deren Phänotyp charakterisiert werden kann.   Schnelle Neutronen-Mutagenese: Hierbei wird durch die Behandlung von Samen mit schnellen Neutronen eine Deletion erzeugt. Die M1-Population wird angebaut und die Samen der M2-Population der individuellen Pflanzen eingesammelt und angebaut. Es wird DNA aus den Individuen der M2-Population extrahiert und 2D oder 3D DNA-Pools erzeugt. Die Pools werden mittels genspezifischen Primern untersucht. Beim Wildtyp ist das Gen noch vollständig vorhanden, bei Deletionsmutanten fehlt ein Stück des Gens. Damit ist das PCR-Produkt der Mutante auch kürzer als das des Wildtyps. Somit kann eine Mutantenlinie identifiziert werden.   Chemische Mutagenese/TILLING: Hierbei wird Guanin durch Ethylmethansolfunat (=EMS) alkyliert. Nach einer Replikation wird das komplementäre Cytosin durch Thymin ausgetauscht. Bei einer weiteren Replikation wird dann das alkylierte Guanin durch Adenin ausgetauscht. Somit wurde aus dem G/C-Basenpaar ein A/T-Paar. TILLING bedeutet dabei Targeting Induced Local Lesions In Genomes. Hierbei wird aus der nicht-chimären M2-Population die aus der chimären, mit Mutagenen behandelten M1-Population durch Selbstung erzeugt wurde, DNA wird isoliert und gepoolt, die Gene von Interesse per PCR amplifiziert. Der Doppelstrang wird denaturiert und Duplexkomplexe erzeugt, wobei jeder der beiden Stränge des Komplexes an gegenüberliegenden Enden markiert ist. Wenn sich aufgrund einer Mutation ein Heteroduplex bildet, wird dieser von CelI gespalten und es entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge als bei einem Homoduplex, der nicht gespalten wird, bestehen bleibt. Die Heteroduplexe werden dann von den Homoduplexen durch Gelelektrophorese unterschieden. Die Mutanten werden dann identifiziert und das PCR-Produkt der Mutanten sequenziert.
• • Was ist TILLING und was sind die wesentlichen Schritte dieser Methode? TILLING bedeutet Targeting Induced Local Lesions In Genomes. Dabei wird zuerst das Saatgut mit chemischen Mutagenen (z.B. EMS) behandelt, um Mutationen zu erzeugen. Dabei wird unter anderem die optimale EMS-Konzentration bestimmt, sodass ein optimales Verhältnis zwischen Überlebensrate der Pflanzen und hoher Mutationsdichte erreicht wird. Die M1-Generation wird angebaut, geselbstet und anschließend die M2-Generation wieder ausgesät. Aus der Selbstung von M2 entstehen M3-Samen, die eingelagert werden. Die M2-DNA wird verwendet um Mutanten zu identifizieren, was über den Verdau von Heteroduplexen erfolgt. Die M3-Samen werden ausgesät und der Phänotyp der identifizierten Mutanten darunter wird untersucht. Bei der Untersuchung der M2-DNA wird folgendermaßen vorgegangen: zuerst wird die DNA verschiedener Individuen gepoolt. Es wird ein Modell für die Zielsequenz des zu untersuchenden Gens erstellt sowie die Primer designed. Die Zielregion wird mittels PCR amplifiziert. Anschließend werden die entstehenden Fragmente denaturiert und ein Annealing durchgeführt. Dabei entstehen Heteroduplexe, wenn Mutationen in der Zielsequenz aufgetreten sind. Die PCR-Fragmente werden mit CelI behandelt, das Heteroduplexe selektiv spaltet. Die Heteroduplexe werden dann mittels DHPLC oder Gelelektrophorese nachgewiesen. Durch die Spaltung der Heteroduplexe entstehen zwei Fragmente, die sich in der Länge voneinander und von dem nicht gespalteten Homoduplex unterscheiden. Damit können Mutanten identifiziert werden und das PCR-Produkt der Mutante kann sequenziert werden.
• • Welchen Vorteil bietet TILLING gegenüber anderen Mutagenesemethoden? Die Vorteile beim TILLING sind, dass es sich auch hier um ein nicht-transgenes Verfahren handelt. Es werden also keine Transgene in die Pflanzen eingebracht, wodurch die Regulationen für deren Anbau wesentlich weniger streng sind. Zudem können neue allelische Variation erzeugt werden, wodurch die Untersuchung von allelischen Serien mit Missense- oder Knock-out Mutationen ermöglicht wird. Es handelt sich um eine Hochdurchsatzmethode.
• Was passiert bei der Mutagenese mit Hilfe von „schnellen Neutronen“? Was sind die Vorteile dieser Methode? Der Beschuss von Zellen mit schnellen Neutronen werden Teile des Genoms deletiert. Je nach Intensität und Dosis der Bestrahlung werden größere oder kleinere Fragmente deletiert. Die meisten Deletionen haben eine Länge von 2 bis 6 kb. Der Vorteil dieser Methode sind, dass sie nicht transgen ist, das heißt dass sie bei der Genehmigung des so gewonnenen Saatguts zur Verwendung für den Anbau nicht den speziellen Regeln für transgene Pflanzen unterworfen ist, was die Zulassung wesentlich einfacher macht. Außerdem werden durch diese Methode hauptsächlich Deletionen erzeugt, die auch ganze Genblöcke (= tandemly repeated genes) entfernen kann.
• • Welche Limitierungen gibt es bei der Insertions-Mutagenese? Die Insertion der T-DNA ist abhängig von den verwendeten Gewebekulturtechniken. Es ist zum Beispiel denkbar, dass die Insertion der T-DNA nicht in allen Arten funktioniert. Außerdem kann diese Art der Insertion auch zusätzliche, unvorhergesehene Mutationen hervorrufen.
• • Welche Ansätze sind möglich um die Genfunktion in Mutanten zu bestätigen? Vergleich WT & Mutante Phänotypische charakterisierung Transkriptionelles level Complementations Test Cosegregation of mutant allele with phenotype in backcrosses
• • Worin sehen Sie die Potentiale von Next Generation SequencingTechniken für die Genomanalyse bei Nutzpflanzen? Next Generation Sequencing (=NGS) Techniken sind im Vergleich zu den traditionellen Sequenzierungstechniken wesentlich billiger. Man kann damit also mehr Sequenzen für weniger Geld und in kürzerer Zeit mit weniger Aufwand bestimmen. Die Sequenzierung von Kulturpflanzengnomen hat diverse Gründe: Die Landwirtschaft wird immer wichtiger als ein wirtschaftlicher Faktor für die wachsende Weltbevölkerung. Damit wird auch die Forschung immer wichtiger, die die Landwirtschaft auf den Bereichen der Lebensmittelsicherheit, Energieeinsparung und Umweltverträglichkeit voranbringt. Um bestimmte Eigenschaften von Pflanzen verbessern zu können, ist es nötig die zugrunde liegenden genetischen und funktionellen Mechanismen zu verstehen, was wiederum nur mit der DNA-Sequenz der jeweiligen Pflanzen möglich ist. Damit können dann auch die genetischen Netzwerke und Mechanismen verstanden werden, die wichtige Eigenschaften wie die Biomasseproduktion, den Ertrag, die Stresstoleranz oder die Qualität der Pflanzen beeinflussen. Außerdem kann auf diesem Weg die Biodiversität und genetische Variation innerhalb und zwischen Spezies ermittelt und festgehalten werden.
• • Nennen Sie Anwendungsbereiche für Next Generation SequencingTechniken. Angewandt wird NGS vor allem zur De novo Sequenzierung, das heißt zur erstmaligen Sequenzierung von noch unbekannten Genomen (z.B. aus genomischer DNA, BACs, Plasmiden oder PCR-Produkten) Es wird vor allem auch zur Resequenzierung genutzt. Dabei wird die Sequenz von Einzelindividuen, für die bereits ein Referenzgenom existiert, ermittelt, um die Unterschiede der Individuen (wie z.B. SNPs) aufzufinden. Weitere Anwendungsgebiete sind die Transkriptomanalyse (wie z.B. Sequenzierung von ESTs oder cDNA und Alignment mit Genom), die Untersuchung der Genregulation durch Betrachten der differentiellen Genexpression, die Metagenomik in der die mikrobielle Diversität auch nicht kultivierbarer Organismen direkt aus der gepoolten DNA aus einem bestimmten Lebensraum bestimmt wird oder die Paleogenomik (= Sequenzierung „alter“ DNA, z.B. aus Ötzi).

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