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Methodenvalidierung (Fach) / sfgrd (Lektion)
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- Richtlinien und Regelwerke ISO Normen (bzw. EN)EU GMP-Guidelines Annex 15ICH Guidelines
- Accuracy (Genauigkeit) • Oberbegriff für Richtigkeit und Präzision• Methodik für Wirkstoffquantifizierungen:– Gehaltsbestimmung des Wirkstoffs mitbekanntem Gehalt (Referenzsubstanz)– Vergleich der Analysenergebnisse mitReferenzmethode, deren Genauigkeit bekannt ist– Genauigkeit kann aus den Parametern Präzision,Linearität und Spezifität abgeleitet werden
- Trueness (Richtigkeit) • Wie nahe ist der Erwartungswert demrichtigen Wert?
- Precision (Präzision) • Maß für die Streuung der Analysenwerte • Messpräzision: durch das Analysengerätselbst verursacht (Durchführung:Mehrfachanalyse derselben Probe) • Methodenpräzision: Maß für die Streuungder Analysenergebnisse insgesamt(Durchführung: Mehrere Proben werden dergesamten Analyse unterworfen)
- Repeatability (Wiederholpräzision) • Laborintern (= ein Labor) erhoben:– ein Prüfer, ein Gerät– ein Ort, „ein Tag“• Durchführung (nach ICH):– min. 6 Bestimmungen (bei 100%)
- Intermediate Precision („Laborpräzision“) • Laborintern (= ein Labor) erhoben, aber:– zwei Prüfer, oder– zwei Geräte, oder– zwei Tage
- Reproducibility (Vergleichspräzision) • Vergleich Labor - Labor:– mehrere Labors– mehrere Prüfer– mehrere Geräte– mehrere Tage
- Specifity (Spezifität) • Störanfälligkeit gegenüber Begleitkomponenten• zu unterscheiden von: Selectivity(Selektivität): Fähigkeit zur Bestimmungmehrerer Komponenten nebeneinander
- Detection limit (Nachweisgrenze) • Kleinste nachweisbare Menge, die aber nichtunbedingt exakt quantifizierbar sein muss• Ja/Nein-Entscheidung
- Quantitation limit (Bestimmungsgrenze) • Kleinste quantifizierbare Menge• „Wieviel“-Entscheidung
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- Linearity (Linearität) • Mess-Signal ist – im gegebenenKonzentrationsbereich – proportional zurAnalyt-Konzentration in der Probe• Zur graphischen Darstellung der Linearitätwird daher üblicherweise das Signal S gegendie Konzentration c aufgetragen• Proportionalität muss nicht zwingend linearsein!
- Range [(Konzentrations)-Bereich • Konzentrationsbereich, für den belegt ist, dass die analytische Methode die gegebenen Anforderungen an Genauigkeit, Präzision und Linearität erfüllt. • Für den Wirkstoff bzw. die Gehaltsbestimmung im Fertigprodukt(nach ICH): 80...120%
- Robustness (Robustheit) • „Widerstandsfähigkeit“ der analytischenMethode gegenüber bewusstherbeigeführten, kleinen Änderungen vonParametern
- Prüfung der Robustness • Beispiel: HPLC-Analytik – pH-Änderung in der mobilen Phase– Änderung der Zusammensetzung der mobilenPhase– verschiedene Säulen (verschiedene Chargen,verschiedene Hersteller)– Temperatur– Flussrate
- Welche Kennwerte sind zu liefern? • Genauigkeit– Abweichung vom „wahren“ Wert– Standardabweichung, Variationskoeffizient– Vertrauensbereich • Vergleichspräzision– zusätzlich Stichprobentest (t-Test, F-Test) • Messbereich / Linearität– Geradengleichung (Steigung, Ordinatenabschnitt)– Korrelationskoeffizient, Bestimmtheitsmaß
- Beurteilung • entspricht / entspricht nicht• an Hand von festgelegten Spezifikationen
- Normalverteilung • Wir gehen davon aus, dass in der Analytik Messfehlernormalverteilt sind• —> Die Grundgesamtheit ist normalverteilt. • Mittelwert: µ (x)• Standardabweichung: σ (s) [Varianz: σ2 (s2) ]• 95% der Werte liegen innerhalb µ–2σ... µ+2σ • Variationskoeffizient(oder: relative Standardabweichung): σ / µ,ausgedrückt in Prozent (engl. RSD)
- Parameter der „Linearen Regression“ • Geradengleichung: y = k . x + d• „Streuungsparameter“:– Korrelationskoeffizient: r (ideal: 1,000)– Bestimmtheitsmaß: r2 (ideal: 1,000)
- Student-Verteilung (t-Verteilung) vereinfacht: Eine Normalverteilung für kleinen Stichprobenumfang • zusätzlicher Parameter: Freiheitsgrade (= n - 1)• (hier) abgeleitete Parameter:– Vertrauensbereich (Konfidenzintervall): µ–σ .f... µ+σ .f• f bezieht sich auf ein bestimmtes Konfidenzniveau undist aus einer t-Tabelle zu entnehmen– Wiederfindung: Vertrauensbereich angegeben in +/- %
- Ausreißer-Tests • 4s-Test• Ausreißertest nach Dean und Dixon
- 4s-Test • Voraussetzung: min.10 Werte, besser ≥ 25• Standardabweichung s und Mittelwert x werden ohne den verdächtigen Ausreißerberechnet• Ausreißer? Ja, wenn Wert außerhalb von 4s
- Ausreißer-Test nach Dean und Dixon (1) • 1. Werte werden aufsteigend sortiert• 2. Der verdächtige Ausreißer (x1) ist dannentweder der erste oder der letzte Wert derReihe• 3. Der Q-Wert wird berechnet:
- Vergleich von Stichproben • Vergleich zweier Stichproben ausunterschiedlichen, normalverteiltenPopulationen:– anhand der Mittelwerte: t-Test • anhand der Mittelwerte:• (vereinfachte Formel für Vergleich mitbekanntem Wert) – anhand der Varianz: F-Test • anhand der Standardabweichungen:
- Vernünftige Messwertangaben • Die Präzision der Messwerte muss bei derProtokollierung zum Ausdruck kommen.• Beispiel: Ablesung von Bürette auf 0,01 mLgenau, z.B.:– 20,24 mL– 18,30 mL (und nicht: 18,3 mL)– 16,00 mL (und nicht: 16 mL)– 13,57 mL (und nicht: 13,570 mL)
- Die Genauigkeit kann sich durch die darauffolgende Berechnung nicht vergrößern... 0,1% = 4 Stellen!