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Trenn und Analysemethoden organischer Arzneistoffe (Fach) / stoff teil 2 (Lektion)

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• Austausch Referenzarzneimittel / Biosimilar • EU: Austausch bzw. Substitution ist nicht von der EMA vorgegeben, sondern ist national geregelt, z.B.• Nicht erlaubt (Frankreich, Deutschland, Griechenland,  Italien, Slowenien, ...)• Muss durch den Arzt untersagt werden (Tschechien)• Offizielle Liste der substituierbaren Präparate(Dänemark, Finnland, Norwegen, Ungarn, Slowakei) • USA: Biosimilars dürfen innerhalb der gleichen Gruppe ausgetauscht werden (Tausch einesPräparates gegen ein kostengünstigeres), wenn nicht aut idem• Austausch Originalpräparat ⇔ Biosimilar ist nicht zulässig • Österreich: Die AGES Medizinmarktaufsicht sieht die Interchangeability positiv.Neuverschreibungen und sogar Umstellungen  vom Referenzprodukt auf Biosimilars sind zweckmäßig, vorausgesetzt, es geschieht unter ärztlicher Beobachtung (2017).
• Bezeichnung Originator / Biosimilar • EU: Biosimilar hat entweder PhantasieHandelsnamen oder aber es wird der Wirkstoffnamein Verbindung mit dem Firmenn • USA: Biosimilar-INN wird durch 4 zusätzliche,willkürlich gewählte Buchstaben ergänztamen verwendet.
• Nukleoside? Cytidin Guanosin Adenosin Uridin Thymidin
• Oligonukleotidsynthese • Nukleinbase mit Schutzgruppe• Desoxyribose (Ribose) mit Schutzgruppe• Phosphatrest als Phosphoramidit (= Phosphitdiestermonoamid) aktiviert • Synthese 3‘ ⇒ 5‘• Kupplung an Festphase (über3‘-OH-Gruppe)• Detritylierung: Gibt 5‘-OH-Gruppe fürKupplung frei (milde Säure)• Kupplung: Phosphoramidit reagiert mitNukleophilen, katalysiert durchTriethylammoniumchlorid,1H-Tetrazol, Pyridiniumchlorid, ...• Capping: Blockierung freier 5‘-OHGruppen (nicht quant. Ausbeute imKupplungsschritt)(Capping durch Acetylierung)• Oxidation: Phosphit > Phosphat durchmilde Oxidationsmittel (z.B. wässrigeIodlösung)
• Spezifität der Hybridisierung ist abhängig – von der Stabilität des Hybridkomplexes(korreliert mit dem Schmelzpunkt)– von der Stringenz der Reaktionsbedingungen Stringente Bedingungen:– nur perfekt basengepaarte Dupliceswerden gebildet und bleiben stabil ->logische Richtigkeit
• Spezifität der Hybridisierung ist abhängig – von der Stabilität des Hybridkomplexes(korreliert mit dem Schmelzpunkt)– von der Stringenz der Reaktionsbedingungen Stringente Bedingungen:– nur perfekt basengepaarte Dupliceswerden gebildet und bleiben stabil ->logische Richtigkeit
• Pyrosequenzierung von DNA – Beobachtung der DNA-Polymerase bei der Synthese des Gegenstrangs– Die vier Nukleotide werden jeweils pro Basenposition hintereinander zugegeben– Bei Einbau des „richtigen“ Nukleotids wird über eine enzymgekoppelte Reaktion Luziferin in Oxyluziferin umgewandelt > Lichtsignal
• Nanopore-Sequenzierung von DNA – DNA wird als Einzelstrang durch eine Pore (Durchmesser im nm-Bereich) geschickt. Über Elektroden wird eine Spannung angelegt und die Stromänderung beim Porendurchtritt gemessen– spezifisch für eine der vier Nukleinbasen– Pore wird durch ein polymergebundenes Protein oder übersynthetische Materalien (Siliciumnitrid, Graphen) realisiert– Max. Leselänge: 2 Megabasen
• DNA - Chips • = DNA-Microarrays• auf einem festen Träger (z.B. Glas, BlottingMembran, Nylon) wird Einzelstrang-DNA in einem Gittermuster aufgebracht• Macroarrays: Spots >= 300 µm• Microarrays: Spots <200 µm • Probes : fixierte DNAs (RNAs) mit bekannter Sequenz• Targets : DNAs (RNAs), deren Identität bzw. Existenz verifiziert werden soll • Macroarrays können manuell auf BlottingMembranen, Glasträgern, ... hergestellt werden. Auslesen mit handelsüblichen Gelbzw. Blot-Scannern.• Microarrays werden mit speziellen High-SpeedRobotern auf Glasflächen hergestellt. Auslesen erfordert spezielles Imaging-Equipment. Das (eigentliche) DNA-Microarray• cDNA-Probes sind auf einem Glasträgerimmobilisiert• Länge der DNA-Abschnitte: 500...5000 Basen• Targets werden einzeln oder in Mischungangeboten
• Der (eigentliche) DNA-Chip • „Oligos“ (= Oligonukleotide) oder Peptidnukleinsäuren werden in situ auf dem Glasträgersynthetisiert („on-chip“) oder nach Synthese aufdem Glasträger immobilisiert(spotted microarray).• Länge der Oligos: 20...80-mer• entwickelt von Affymetrix, Inc. (GeneChip®)
• Anzeige
• Anwendungen für Microarrays Zielsetzungen • 1. „Gene Discovery“• 2. Diagnose von Krankheiten• 3. „Drug Discovery“ - Pharmacogenomics : Korrelation zwischen therapeutischem Effekt des Pharmakons und  genetischer Ausstattung des Patienten• 4. Toxikologie - Toxicogenomics : Korrelation zwischen Reaktion auf ein toxisches Agens und genetischer Ausstattung des Exponierten Diagnose von Krankheiten Virusinfektionen • AmpliChip CYP450 (Roche): zur Analyse derVariationen auf den Genen für CytochromP450 2D6 und 2C19
• Nukleinsäuren als Arzneistoffe • Antisense-RNA– Antisense-RNA bindet an mRNA und inhibiert somit die Translation– Fomivirsen: Virostaticum gegen das Cytomegalie-Virus – Einsatz von Antisense-RNAs auch in derBiotechnologie (Flavr-Savr-Tomate, AmfloraKartoffel)
• Die wichtigsten Funktionsprinzipien von Transduktoren Transduktor: wandelt Molekülerkennung in Mess-Signal um • Physikalisch– Kalorimetrie • Messung der Wärmeabgabe (bei exothermenReaktionen) durch einen Thermistor(Halbleiterelement zur Temperaturmessung)– Mikrogravimetrie • Nach Sauerbrey (1959) korreliert dieFrequenz eines Piezokristalls (in einemSchwingkreis) mit dessen Masse– Optisch • Durch Lichtleiter kann eine räumlicheTrennung von Detektor und Analyt erreichtwerden• Messprinzipien:– Winkelabhängige Reflexion einesLichtstrahls an Goldfolie, die als Träger derBiomoleküle fungiert– Löschung der Fluoreszenz vonFluoreszenzfarbstoffen durch O2 • Chemisch– Optisch– Elektrochemisch • Potentiometrie:– Potentialmessung an ionenselektivenElektroden (für H3O+ (pH-Elektrode) undeine Reihe von Kationen und Anionen)– Basis: U ~ log c (Nernst-Gleichung)• Amperometrie– Strommessung auf Basis vonReduktion/Oxidation– Basis: I ~ c • Konduktometrie:– Leitfähigkeitsmessung an parallelangeordneten Platinelektroden– Leitfähigkeitsmessung mit modifiziertenFeldeffekttransistoren– Basis: L = 1/R ~ c
• „Erkennungsfähige“ Moleküle: – Enzyme– Antikörper– Aptamere– Spiegelmere
• Enzyme • Enzym ist immobilisiert• Reaktionsprodukt der enzymatischen Reaktionwird gemessen:– pH-Wert-Änderung > pH-Elektrode– Bildung von Ionen: Leitfähigkeits-messungbzw. Ionenselektive Elektrode– exotherme Reaktion: Temperatur– Bildung von Gasen: Druckänderung
• Glucose-Sensor 1• Optische Messung des O2-Verbrauchs2• Messung des entstehenden H2O2:– amperometrisch (Oxidation)– optisch (Luminiszenz, Photometrie)3• Mikrokalorimetrie4• pH-Wert-Messung - enzymatische Spaltung (mit DGluconolactonase) zu D-Gluconsäure D-Glucose + ½ O2 (1) + H2O Glucoseoxidase→ D-Gluconolacton + H2O2 (2)  + 28 kJ/mol (3) D-Gluconolacton -> D-Gluconsäure (4)
• Aptamere • DNA- oder RNA-Oligos (25...70 Basen) mit hoher Affinität zu bestimmten Stoffen, vergleichbar der Antikörper-Antigen-Bindung • Affinität ist nicht auf Proteine (und Peptide) beschränkt, es können auch niedermolekulareStoffe, Aminosäuren, Antibiotika, ... spezifisch gebunden werden • Prinzip der Erkennung: Adaptive Bindung – Aptamer faltet sich „um“ den Bindungspartner (via elektro-statischer Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, Base Stacking) Herstellung von Aptameren• Generierung einer Zufallsbibliothek• Variabilität: 1014...1015/µmol (das entspricht max. 25 Basen bei min. 600 Kopien/Aptamer)• Selektion der bindenden Aptamere z.B. via Ligandenaffinitätschromatographie• Sequenzbestimmung des gebundenen Aptamers• Gezielte Oligosynthese des Aptamers ->SELEX
• SELEX Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment Immobilisierter Target auf Träger wird mit ssDNA Oligonukleotiden gemischt und Träger abgetrennt. Die DNA werden anschließend eluiert und mutiert -> nächster durchgang
• Spiegelmere • Enantiomere RNA-Oligos• Künstlich hergestellt aus L-Nukleotiden (enthalten als Zuckerbaustein die unnatürliche L-Ribose)• Enzymatisch stabil• Geringe Antigenität• SELEX-Verfahren nur einsetzbar übergespiegelte Zielmoleküle!
• Einsatzgebiete von Biosensoren • Produktionsüberwachung (Pharma, Lebensmittel)• Umweltanalytik• Lebensmittelanalytik• Medizin:– Diagnostik (extrakorporal!)– Operationsüberwachung, künstliche Organe: intrakorporal sind gegenwärtig nur optische Sensoren einsetzbar (Sterilisierung notwendig!)
• Vorteile / Nachteile der enzymatischen Analyse • Vorteile– Reaktionskaskade kann als Eintopfreaktion durchgeführt werden– Einfache Durchführbarkeit– Hohe Spezifität– Hohe Empfindlichkeit– Niedrig liegende Bestimmungsgrenze (10-16 Mol/l)• Nachteile– Biologische Bedingungen müssen simuliert werden (kritisch:Lösungsmittel, Schwermetalle, allgemein: Verunreinigungen)– Enzyme sind teuer Aus kaufmännischer Sicht sind aber auch Arbeitszeitund Geräteamortisation zu berücksichtigen!
• Messtechniken enzymatischer Analyse Meßgröße            Meßtechnik      BeispielLichtabsorption    Photometrie     NADP(H)-abhängige Reaktionen Proteasen über p-NitroanilideLumineszenz       Luminometrie   Kinasen über ATP/LuciferaseO2-Gehalt           Polarographie   Glucose-OxidasepH                      Titrimetrie       LipasepX                      IS-Messung      AminosäureoxidasenLeitfähigkeit        Konduktometrie UreaseDruck                 Manometrie      Decarboxylasen
• Cholesterin Enzymatische Analytik Cholesterin wird über Cholesterin-oxidase gespalten in H2O2 uns etc. Das H-peroxid oxidiert Methanol zu Formaldehyd über Katalse und zusammen mit Ammonium und 2,4-Pentandion wird daraus 1,1'-(2,6-Dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-diyl)diethanon -> messbar bei 405nm
• Detektion von NADH und NAD+ PMS.... 5-Methylphenaziniummethylsulfat MTT.... 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2-)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid NADH reduziert PMS und PMS reduziert MTT ->  lila farbe 578nm
• Ascorbinsäure Analyse • Ascorbat + MTT PMS→ Dehydroascorbat + MTT-Formazan • Ascorbinsäure wird durch Ascorbinsäureoxidase selektiv oxidiert
• Bedingungen für enzymatische Reaktionen • pH-Wert: Puffer ausreichender Pufferkapazität. Achtung: Metallionen, Temperatur• Temperatur (Reaktionsgeschwindigkeit!)• Reinheit des verwendeten LM (Wasser)• Qualität des Enzyms (Reinheit/Stabilität/Aktivität)
• Die Qualität bei Enzymen • Reinheit– Fremdaktivitäten: Verunreinigung durch andere Enzyme– Nebenaktivitäten: Enzym setzt auch andere Substrate als das eigentliche um• Aktivität• Stabilität• Präparationsform• Verpackung
• Bestimmung der Enzymaktivität • Bestimmung von Enzymspiegeln in biologischen Materialien– medizinische Diagnostik– Biochemie und Mikrobiologie– Biotechnologie• Qualitätskontrolle von Enzympräparaten– Ermittlung der Enzymausbeute– Charakterisierung von Enzympräparaten

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