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Trenn und Analysemethoden organischer Arzneistoffe (Fach) / stoff teil 2 (Lektion)

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• Peptidsynthese pros n cons • Vorteil: Freiheit in der Sequenz – Beliebige Sequenzen - unter Verwendungbeliebiger Bausteine - können aufgebautwerden• Nachteile: Methodische Grenzen– „Chemische Peptidsynthese, aber keinechemische Proteinsynthese“
• Eindeutige Reaktion zweier AS PG1-NH-Ala-Ile-O-PG2 PG = protective (protecting) group
• Schutzgruppen für die Amino-Gruppe • 1. „Amid“-PG– Urethan-PG– (Echte) Amid-PG• 2. Trityl-PG• (3. Phthalyl-PG)
• Carboxyl-Gruppe (in der SK) gefahren bei synthese • Gefahren: SK-Carboxylgruppe wird beiCarbonsäureaktivierung mitaktiviert– Bildung unerwünschter b- bzw. g-Peptide– Bei freiem N-Terminus Bildung cyclischer b- bzw. g-Peptide– Succinimid-Bildung bei benachbartem Gly, Ala, Ser PGs für die Carboxyl-Gruppe • O-tert.Butyl-Ester (tBu) • O-Benzylester (Bn) • O-1-Adamantylester (1-Ada)
• Amid-Gruppe (in der SK) Gefahren • Gefahren: Schutz wäre nicht unbedingt notwendig, aber Gefahr der Dehydratisierung bei COOH-Aktivierung durch best. Reagentien• Maßnahmen: Zusatz von HOBt reduziert die Gefahr der Nitrilbildung • Trityl-Schutzgruppe (Trt)
• Guanidino-Gruppe Gefahren • Arginin ist die AS mit der am meisten basischen SK Funktionalität• Gefahren:– Brückenbildung über die Guanidino-Gruppe– Deaktivierung aktivierter Carbonsäuren über die Bildung nicht reaktiver Lactame • Pentamethylchromansulfonyl-Gruppe (Pmc) • Methoxytrimethylbenzolsulfonyl-Gruppe (Mtr)
• Imidazolring im Histidin Gefahren: • Im Imidazolring sind zwei Stickstoffe:– t: der „entferntere“– p: der „nähere“ - zum Peptid-Rückgrat• Bildung verzweigter Peptide über den Imidazolring ist kein Problem!• Gefahren:– Racemisierung durch Aciditätsverstärkung des a-H– ⇒ Gefahr nur im Kupplungsschritt! Trityl-Schutzgruppe (Trt) Boc-Schutzgruppe (Boc)
• Amino-Gruppe (in der SK) • Gefahren: Bildung verzweigter Peptide durch Konkurrenzreaktion der ε-Aminogruppe– Bei Peptidverlängerung in N-Richtung schwierig zu identifizierende „Analogpeptide“ Boc-Schutzgruppe (Boc) Cbz-Schutzgruppe (Z)
• Hydroxyl-Gruppe Gefahren • Tyrosin-OH ist acid!• Gefahren: Esterbildung bei Ser und Thr • t-Butyl-Ether (tBu)
• Mercapto-Gruppe Gefahren • Gefahren:– Thiole sind nucleophil– Ausbildung von Disulfidbrücken– Problematisch an best. Peptidpositionen• eine schwierig zu schützende (und zu entschützende!) Funktionalität... • Trityl-PG (Trt) • Acetamidomethyl-Schutzgruppe (Acm) • als t-Butyl-Thioether (tBu) • als t-Butyl-Disulfid (tBu)
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• Peptidsynthese in Lösung Durchführung N ⇐ C – Start am C-Terminus mit stabilem Ester-Ende– Verlängerung in N-Richtung mitN-geschützten COOH-aktivierten AS– Entschützung am N– Abspaltung der Endschutzgruppen und derSK-Schutzgruppen • Durchführung: N ⇒ C – Start am N-Terminus mit stabilem Amid-Ende– Verlängerung in C-Richtung mit AS-Estern– Entschützung an der COOH-Gruppe– Aktivierung der COOH-Gruppe -> mit aktivester– Abspaltung der Endschutzgruppen und der SK-Schutzgruppen
• Peptidsynthese in Lösung Probleme und Grenzen • Löslichkeit ?• Racemisierung– beim Anbringen der Schutzgruppen– bei der Kopplung• Trennproblem bei unvollständiger Umsetzung– Komplexität (Mischung Edukte/Produkt) und Ähnlichkeit (Edukt/Produkt) nehmen mit der Kettenlänge zu
• Merrifield Peptidsynthese • Reaktionen „bestehen“ nur in Reagenszugabe  und Waschen• Keine Reinigung der Zwischenprodukte• Keine Charakterisierung der Harz-gebundenen Zwischenprodukte⇒ schnell, einfach, effizient⇒ begründete Skepsis (im Vergleich zur konventionellen Methodik) Festphase -- Linker -- Molekül kovalent gebunden
• Festphasen • Solid Phase, „Harz“• Eigenschaften– Polymer, inert in den verwendeten LM– mit geeigneten Funktionalitäten zur Anbringung des Linkers– quellfähig ⇒ Beladungskapazität– günstig: billig in der Herstellung
• Linker • Charakteristik– „passt die Festphase an die jeweilige Reaktion an“– inert gegenüber den auszuführenden Reaktionen– verbleibt stabil an der Festphase während der Reaktionen– milde Abspaltung des Produkts, womöglichst mit flüchtigen Reagentien Wünschenswert:– hohe Ausbeute der Abspaltungsreaktion– Ausbeute der Abspaltungsreaktionunabhängig von der Struktur des„angehängten“ Moleküls– Molekülkupplung ohne größere Probleme– einfache Synthese des Linkers
• Festphasen-Peptidsynthese Generelle Strategie Solid Phase Peptide Synthesis = SPPS• Peptid wird vom Carboxylende her aufgebaut• Einsatz N-geschützter (und Seitenketten-geschützter) Aminosäuren– Boc-Strategie -> mit tri Fluor essigsäure Boc Gruppe weg, mit Flusssäure von Linker weg– Fmoc-Strategie
• Fmoc-Schutzgruppe Charakterisierung • Fmoc = Fluorenylmethyloxycarbonyl• 1972, Carpino• eine basisch abspaltbare Urethan-PG, gegenüber Säuren stabil• analytisch nutzbar: bei der Abspaltung frei werdendes Dibenzofulven Einführung: mit Fmoc-Cl, Fmoc-Anhydrid oder Fmoc-OSu Fmoc-Schutzgruppe Nachteile • Amino-PG bilden inerte, oft flüchtige Produkte bei der Abspaltung. Dibenzofulven ist reaktiv:Addition + Polymerisation ⇒ das ist aber gerade bei der Festphasensynthese kein Problem Mit Piperidin wird die Fmoc Gruppe abgespalten mit Trifluoressigsäure wird dann vom Linker  abgespalten
• Harze in SPPS Auswahl • Polystyrol, quervernetzt mit 1% Vinylbenzol– Grundtype für Batch-Mode Synthese– billig herstellbar– gutes Quellvermögen in DCM, DMF und NMP– leicht funktionalisierbar via FC-Reaktion zu Chlormethyl-, Aminomethyl-, Benzhydrylamino- • Polystyrol für Continous-Flow Synthese– nur verwendbar in Co-Packung mit Glasperlen– oder bei Einsatz niederer Drücke • Polydimethylacrylamid für Continous-Flow Synthese– „gemeinsam“ mit Kieselgur (Macrosorb®,NovaSyn K®)– „gemeinsam“ mit Polystyrol (Polyhipe®)• Polyacrylamid für Continous-Flow Synthese:– „gemeinsam“ mit Diatomeen-Erde (PepSyn K®) • Nachteil der Polyacrylamid/“Inerte Füllmaterialien“-Polymere“– mechanische Stabilität unbefriedigend– Entpackung bei langen Laufzeiten– unregelmäßige Partikel führen zur „Kanalbildung“
• Linker in SPPS • Wahl des Linkers ist abhängig von der gewünschten C-Endfunktionalität:– Carbonsäure– Amid– Ester oder anderes Carbonsäurederivat Wang - Harz Rink-Säure-Harz  viel milder sauer spaltbar 2-Chlortritylchlorid - Linker viel milder sauer spaltbar Rink-Amid - Harz Sieber-Amid - Harz 4-Hydroxymethylbenzoyl (KB) -Linker durch Nukleophile spaltbar 3-Nitro-4-hydroxymethylbenzoyl - Harz Linker durch Nukleophile spaltbar
• Protokoll - Fmoc-SPPS 1. Quellen des Harzes• Gewählte Menge an Harz in DMF (besser: DCM) quellen lassen (5...10 min) 2. Attachment der ersten AS • Off-Line Esterbildung (1)– Generierung symmetrisches Anhydrid• Fmoc-AS-OH (12 eq!) wird in DCM gelöst (ev. unter Unterstützung von DMF)• Zusatz von 6 eq.. DIPCDI (DIC)• Rühren bei RT, 10 min• DIPU abfiltrieren, Filtrat eindampfen • Off-Line Esterbildung (2)– Acylierung des Supports• Anhydrid in wenig DMF lösen• DMAP (berechnet auf die Menge der HarzFunktionalitäten) in DMF zusetzen• Fmoc-AS-OH (12 eq!) wird in DCM gelöst(ev. unter Unterstützung von DMF)• Schwenken und 1...2 h ohne Rühren (!) stehenlassen• Abfiltrieren, 5x mit DMF waschen Abschätzung des Attachment Levels • Durchführung:– Eine gewogene Menge Harz in einer UVKüvette mit 3 ml Piperidin/DMF (1:4) versetzen und 3 min lang vorsichtig durchmischen. Der Überstand wird UVphotometrisch bei l = 290 nm vermessen (Referenz: Piperidin) 3. Abspaltung des Fmoc-Restes– „Abspaltlösung“: Piperidin/DMF (1:4) oder Piperidin/DBU/DMF (1:1:48)– Das Harz 3 min lang mit der Abspaltlösung behandeln– Lösung absaugen und die Abspaltung noch 3...4x wiederholen– Harz mit DMF waschen 4. Aktivierung der AS und Kopplung– Aminosäure in 3...4fachem Überschuß als Aktivester anbieten oder Aktivester in situ  generieren– Reaktionszeit: 20...60 min– Vollständigkeit der Kopplung mit KaiserTest überprüfen– Harz mit DMF waschen 5. Peptidkettenverlängerung• ...• 3. Abspaltung des Fmoc-Restes• 4. Aktivierung der AS und Kopplung• 3. Abspaltung des Fmoc-Restes• 4. Aktivierung der AS und Kopplung• 3. Abspaltung des Fmoc-Restes• 4. Aktivierung der AS und Kopplung• 3. Abspaltung des Fmoc-Restes• 4. Aktivierung der AS und Kopplung 6. Ablösen vom Harz (mit SK-Entschützung)– Harz muss DMF-frei sein!– Getrocknetes Peptid-Harz in einen Kolbenüberführen und mit Spaltungsreagens(„Cleavage Cocktail“) bedecken– 1,5...18 h stehen lassen– Abfiltrieren, Harz 2x mit TFA waschen– Filtrate kombinieren und Peptid isolieren
• SPPS-In Prozeß-Analytik Qualitativer Kaiser-Test • „Kaiser-Reagens“:– Lösung 1: 5 g Ninhydrin / 100 ml Ethanol– Lösung 2: 80 g Phenol / 20 ml Ethanol– Lösung 3: 2 ml einer 0,001M wäßrigen KCNLösung + 98 ml Pyridin • Durchführung:– Einige Harzkörnchen auswählen, mit Ethanol waschen– Je 1 Tropfen der Lösungen 1 bis 3 auftragen– Gut durchmischen und für 4...6 min auf 120°C erhitzen
• Probleme (bei der SPPS) Zusammenfassung • Aggregatbildung• Racemisierung• Nebenreaktionen• Problemsequenzen
• Problemsequenzen SPPS • Sammlung in Datenbanken• Voraussageprogramme, basierend auf Daten hunderter Peptide• Ab initio Rechnungen, ausgehend von bekannten Proteinstrukturen• Korrelation zwischen Löslichkeit und Struktur Bildung von Disulfidbrücken• Verwendung einer einheitlichen PG– Gemeinsame Entschützung– „Selbst“-Ausbildung der Disulfidbrücken (Luftoxidation, milde Oxidationsmittel)• Verwendung differenzierbarer (orthogonaler) PG– zur gezielten Knüpfung von Disulfidbrücken zwischen Peptiden Phosphopeptide• In eukaryotischen Zellen Phosphorylierung durch Proteinkinasen• Synthese am Harz:– Strategie 1: Verwendung von SKphosporylierten Fmoc-AS (Ser,Thr,Tyr) in der Kettenverlängerung– Strategie 2: „Nachphosphorylierung“ am Harz-gebundenen Peptid Glykopeptide• In eukaryotischen Zellen:– N-Glykoside: Asn + definierte Pentose-Kette– O-Glykoside: Ser, Thr, Hydroxy-Lysin + versch. Zucker• Glykopeptid-Synthese nur am Harz erfolgreich, allerdings anspruchsvoll und aufwendig (Schutz der Zucker-OH): Aufbau des Glykopeptids über glykosylierte Fmoc-AS
• Zusammenfassung Vorteile - SP(P)S • Vollständige Umsetzung und Reaktionsbeschleunigung (durch hohen Überschuß des gelösten Reaktionspartners)• Ersatz komplexer Aufarbeitungs- und Reinigungsschritte durch einfaches Waschen des Trägers• Einfache, vollständige Automatisierung von Reaktionssequenzen • Deutlich längere Peptid-Ketten synthetisierbar (im Vergleich zur „Peptidsynthese in Lösung“)• Verdünnungsprinzip günstig (Quervernetzungen, Interaktionen der Substratmoleküle minimiert)
• Nachteile - SP(P)S • Harz + Linker schränken die Reaktionsbedingungen und die Wahl der Reagentien ein.• SPS allgemein: Syntheseentwicklung = Übertragung von Reaktionsbedingungen „Lösung⇒ Harz“ aufwendig [SPS]– Entwicklungsstand der Festphasensynthese noch geringer als Entwicklungsstand der „klassischen Lösungschemie“ • Möglichkeiten der Reaktionsverfolgung sind stark eingeschränkt, z.B. DC• Analytische Routinemethoden der „Lösungschemie“ nicht einsetzbar, z.B. UV/vis, NMR (eingeschränkt), DC
• Kleine Peptide - allgemein: Methoden der Small Molecules - Analytik • Strukturaufklärung / Identität– NMR– (IR)– MS• Reinheit / Gehalt– HPLC– CE
• • Bestimmung der N-terminalen AS – Die N-terminale Aminosäure wird chemisch(mit 2,4-Dinitro-1-fluor-benzol oderDansylchlorid) von der Polypeptidkettegetrennt und bestimmt...
• • Aminosäurezusammensetzung prozentuell  Zur Überprüfung: Ist Zusammensetzung mitbekannter Sequenz vereinbar?– Aminosäurenanalyse (2.2.56; Ph.Eur. 9.3)– Prinzip: Hydrolyse des Peptids/Proteins undquantitative Analyse der Aminosäuren imHydrolysat
• AS-Zusammensetzung Grundlagen: Stein & Moore – Trennung der AS nach saurer Hydrolyse an Stärkesäulen– Detektion der AS mit Ninhydrin (Nachsäulenderivatisierung)• Später: Trennung an saurem IAT-Harz • Probleme:– mit instabilen AS (Ser, Thr, Trp)– Met kann oxidiert werden– Cys > Cystin– Hydrolyse von Asn (Gln) zu Asp (Glu)– max. 17 (versch.) AS quantifizierbar
• Aminosäurenanalyse nach Ph.Eur. Hydrolyse • 11 verschiedene Methoden der Hydrolyse (in Abhängigkeit von der AS-Zusammensetzung)• Gängigste Methode (Methode 1): Hydrolyse mit phenolhältiger Salzsäure (6 M). Phenol verhindert die Halogenierung von Tyr.• Dauer: 24 h bei 110 °C im Vakuum (auch 48...72 h)• (Meistens) Durchführung als Gasphasenhydrolyse in verschlossenen Proberöhrchen. Hydrolyseflüssigkeit wird im Vak. verdampft und kommt nicht direkt mit der getrockneten Probe in Kontakt).
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• Aminosäurenanalyse nach Ph.Eur. Quantitative Analyse • Variante 1– Trennung über Ionenaustauschchromatographie– Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin (oder o-Phthaldialdehyd)– Vorteil: Robuste Methode• Variante 2– Vorsäulenderivatisierung mit div. Reagentien– RP-HPLC– Vorteil: Sehr empfindlich, max. 1 µg Probe erforderlich– Nachteil: Bestimmte AS können mehrere Derivateergeben
• Methodische Verbesserungen: Vorsäulenderivatisierung o-Phthaldialdehyd (OPA) keine Reaktion mit sek.Aminen → zuerst oxidieren  • Phenylisothiocyanat (PITS) • Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid (Fmoc-Cl) reagiert bei pH = 4.2 mit prim. und sek. Aminen • Dabsylchlorid (DABS-Cl) reagiert bei pH = 9.0 (70 °C, 15 min) mit prim. und sek. Aminen es muß ein 4-facher Überschuß des Reagens ziemlich genau eingesetzt werden • 6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamat (AQC) • 4-Fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol
• • Sequenzierung Proteinanalytik • Sequenzierung– Chemischer Abbau und Identifizierung derabgebauten AS• vom N-Terminus: Edman-Abbau• vom C-Terminus: Schlack-Kumpf-Abbau– „Direkt-Sequenzierung“ durch MS/MSTechniken
• Spaltung von Peptiden • Chemische Spaltung von Peptiden– z.B.: BrCN spaltet nach Met– z.B.: Hydroxylamin (NH2OH) spaltet Asp-Gly• Enzymatische Spaltung von Peptiden– Exopeptidasen• N-terminal (Aminopeptidasen)• C-terminal (Carboxypeptidasen)– Endopeptidasen
• Edmanabbau phenylisothiocyanat bindet an N-terminus  Spaltung mit Trifluoressigsäure (ohne H2O) die ATZ (Anilinothiazolinon) -> mit H+ -> Ring öffnet sich -> PTH (Phenylthiohydantoin) Aminosäure
• Edman-Abbau Das Problem der repetitiven Ausbeute • bestimmt direkt die sequenzierbare Peptidlänge• durch Automatisierung: > 90%• Heute: > 95% (= 30...40 AS)• Bestimmungsgrenze: <10 pmol– AS-Analytik: 1 pmol (HPLC)
• Probleme der Sequenzierung • Problematische AS geben kleinere oder mehrere Peaks– Ser, Thr, Cys, Trp werden zerstört– His, Arg werden schlecht extrahiert– Lys ist oxidationsempfindlich• Modifizierte AS– erscheinen als „normale“ AS– erscheinen bei der Retentionszeit bekannter AS • Probleme der Probe– es liegen mehrere Proteine vor– Kontaminationen mit Salzen, Detergentien, freien Aminosäuren• Probenaufgabe– sehr kleine Proteinmengen werden oft anOberflächen adsorbiert• Kontamination des Gerätes bei laufender Analyse„größerer“ Proteinmengen • N -terminale Blockierung!!!• Anfangsausbeute (initial yield) oft nur 50%• Qualität der Chemikalien• Empfindlichkeit des HPLC-Systems. Forderungen:– Bestimmungsgrenze: 1 pmol– Trennung in 15...25 min
• Festphasen-Sequenzer • „Edman-Abbau“ an der Festphase• Vorteile:– vollständige Sequenzierung bei Fixierung des C-Terminus– drastischere Bedingungen für den Sequenzabbau möglich– Verlängerung der Waschschritte erhöht Ausbeute– Ausbeute: > 96% (= bis zu 80 AS) • Nachteile:– wird die Fixierung über AS-SK erreicht, dannist diese AS nicht in der Sequenzinformation– effiziente Kopplung an Festphase nötig (hoheAusbeute erforderlich)
• Schlack-Kumpf-Abbau • ähnlich dem Edman-Abbau• Durchführung– Umsetzung mit Thiocyanat-Reagens– Trennung und Identifizierung derentstandenen AS-Thiohydantoine Essigsäureanhydrid lagert sich an beide Termini und mit Thiocyansäure wird ein Hydantoin am  C-Terminus abgebaut • scheitert bei Asp und Pro• Bestimmungsgrenze: 1 nmol• Schlechte repetitive Ausbeute– 75...85% (= 3-5 AS, max. 10 AS)
• Verbesserte C-Sequenzierung • Ersatz der Thiocyansäure durch:– Triphenylgermanylisothiocyanat (Li & Liang: 8 AS)– Tribenzylsilylisothiocyanat– Diphenylphosphorylisothiocyanat• bis zur Länge von 15 AS (?) sequenzierbar• Bestimmungsgrenze: <10 pmol
• Triple-MS Produkt-Ionen-Analyse Q1 -> m/z-Scanning / massenfilter Q2 -> Fragmentierung Q3 -> m/z-Scanning / massenfilter Messmodi: Q1/Q3 Produkt-Ionen-Analyse konst/Scan Vorläufer-Ionen-Analyse Scan/konst Neutralverlust-Analyse Scan/Scan
• MALDI-TOF Reflektor-Flugrohr PSD-Mode (Post Source Decay) kleinere schneller als große
• Leitersequenzierung Kombination aus Edman-Abbau und MALDI-Massenspektrometrie Edman-Abbau mit 95% Phenylisothiocyanat in Gegenwart von 5% Phenylisocyanat durchführt, wobei sich in jedem Zyklus eine bestimmte Menge eines säurestabilen Phenylcarbamoyl- (PC)-Peptids bildet (Abb.)
• Alternative Leitersequenzierung • Protein mit N-Exopeptidasen und C-Exopeptidasen abbauen• Verdau wird direkt auf dem MALDI-Träger angesetzt
• Peptidmustercharakterisierung • zur Identitätsprüfung von Proteinen• Prinzip:– Spaltung des Proteins mit Spaltungsreagentien oder Proteasen– Trennung der Peptidfragmente durch Chromatographie oder Elektrophorese– Vergleich des erhaltenen Fragmentmusters mit Referenzmuster
• Peptidmustercharakterisierung Trenntechniken • Umkehrphasen-HPLC• Ionenaustauschchromatographie• Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung• PAGE, nicht denaturierend• SDS-PAGE• Kapillarelektrophorese
• Protein Fingerprinting • In-Gel-Verdau• HR-MS (high resolution MS) der durch Verdau erhaltenen Peptide• Vergleich der Messdaten mit:– Datenbanken– via Computer-Programme, die berechnen
• In-Gel-Verdau Workflow • Zweidimensionale Gelelektrophorese• Färbung• Ausstanzen der interessanten Spots• Entfärbung• Verdau: meistens mit Trypsin, vorher Entwässerung mit Acetonitril und Einlegen in Verdaupuffer• Extraktion der Peptide
• Peptide Mapping • Verdau des Proteins mit mehreren Proteasen• Analyse der Peptidmischung via LC-MS/MS• Die Peptidsequenzen werden übereinandergelegt und mit der Originalsequenz verglichen
• 3D-Struktur-Bestimmungsmethoden • NMR-Methoden• CD-Spektroskopie• Elektronenmikroskopie– Transmissionselektronenmikroskopie– Rastensondenmikroskopie• Röntgenstrukturanalyse

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