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Trenn und Analysemethoden organischer Arzneistoffe (Fach) / stoff (Lektion)
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- Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) für Substanzen, die mit UV- und anderen Detektoren nicht oder nur schwererfassbar sind (keine UV-Absorption, Fluoreszenz etc.) leistungsfähigere Alternative zum Brechungsindex-Detektor; unselektiv Funktionsprinzip: Eluat wird in einem Inertgas-Strom fein zerstäubt, Tröpfchen werden durch ein beheiztes Rohr geleitet, wobei das Lösungsmittel verdampft; es verbleiben sehr kleine feste Partikel (als „Nebel“), die durch einen Laserstrahl geleitet werden und diesen teilweise streuen; die Intensität des Streulichtes wird mittels Photodiode gemessen; Voraussetzungen: mobile Phase muss vollständig flüchtig sein,Analysensubstranz darf nicht flüchtig sein
- HPLC: Aerosoldetektor Funktionsprinzip Erzeugung eines AerosolsAbdampfen der mobilen Phasedie getrockneten Teilchen werden mit Wasserdampf beschlagendie dadurch deutlich vergrößerten Teilchen werden gezählt Vorteile hohe Empfindlichkeitgroße Dynamik (= weiter Messbereich: lg 3...5)sehr gute Reproduzierbarkeit Zusatzinformationen unselektiv, aber für Substanzen ohne Chromophor anwendbar
- HPLC: Mehrwinkel-Streulichtdetektor Multi-Angel Scattering Detector (MALS) Funktionsprinzip durch Messung unter verschiedenen Winkeln lassen sich darüber hinausPartikelgröße und Molmasse bestimmen. Gerätespezifikationen am Beispiel von DAWN (WYATT Technology) Messbereich Molmasse: 200 Da ... 1 GDaMessbereich Molekülgröße: 10 ... 500 nmZahl der Messwinkel: 18
- HPLC: MS-Spektrometer als Detektor Vorteil: hoher Informationsgehalt → Hochleistungstrennverfahren + Verfahren zur Strukturaufklärung Großer apparativer Aufwand zur Kopplung der beiden Geräteteile (HPLC +MS) → Fließmittel muss entfernt werden (versch. Spray-Verfahren, z.B.„Electrospray“); Einschränkungen z.B. bei Wahl von Pufferlösungen
- HPLC: Detektor-Output • analoges elektr. Signal (Ausnahme: Diodenarray, MS)• Spannung proportional Signalintensität, via A/D-Wandler überComputer verarbeitbar• qualitative Information: Anzahl d. Peaks, Retentionszeiten(Identifizierung von Substanzen)• quantitative Information: Fläche (ev. Höhe) eines Peaks→ Rückschluss auf Substanzmenge
- HPLC: Trennmechanismen in Abhängigkeit von der stationären Phase • Adsorption: polare stationäre Phase; Kieselgel (Si-OH-Gruppen): schwach sauerAluminiumoxid: meist basisch - neutral apolare mobile Phase: z.B. Kohlenwasserstoffe, Ether: definierter Wassergehalt! (z.B. 50% Sättigung) langsame Gleichgewichtseinstellung; Problem: Reproduzierbarkeit • Verteilung: meist als Reversed-Phase-Chromatographie: RP-Säulen a) Flüssig-flüssig-Verteilung: apolare flüssige stationäre Phase (aufinertem porösem Trägermaterial); polare (wässrige) mobile Phase;Gefahr des „Ausblutens“ der stat. Phaseb) chemisch gebundene Phasen (heute üblich): Alkylkettenkovalent mit Kieselgel verknüpft, z.B. RP-18
- HPLC: Einflussmöglichkeiten auf Trennung und Detektion • stationäre Phase: Trennmechanismus (und damit Selektivität)• mobile Phase: bei Adsorption und Verteilung: Polarität• Gradientenelution: binär, ternär; auch Flussgradient (innere/äußere Gradienten)• Temperatur: Säulenofen, Wasserbad• Geräteparameter: Flussrate (0,1...10 ml/min)Derivatisierung (zur besseren Detektierbarkeit)• vor der Injektion: pre-columnVorteil: Reaktionsbedingungen frei wählbar; chrom. Eigenschaften der Probe u.U. verbesserbarNachteil: Gefahr von Artefakten, ev. keine quant. Umsetzung• nach der Elution (kurz vor Detektor): post-column Vorteil: Nebenprodukte irrelevant; zusätzlich 2. Detektor möglich Nachteil: technisch aufwendig, Reaktion muss in mobiler Phase ablaufen können, Reagens selbst darf kein Signal liefern
- HPLC: Anwendung • Analytik:sicherlich die breitest eingesetzte analytische Methode in der . Pharmazeutischen Analytik, für Apothekenanalytik allerdings zu kosten- und zeitintensiv Methode der Ph.Eur. (2.2.29 Flüssigchromatographie) universelle Methode, sehr flexibel, gut standardisierbar, auch für sehr geringe Probenkonzentrationen geeignet; quantitative Bestimmungen gut reproduzierbar; durch Kombination mit speziellen Detektoren (Diodenarray, Massenspektrometer) großer Gewinn an Information Trend: Ultra-HPLC (UHPLC, UPLC): noch kleinere Korngrößen, höherer Druck, kürzere Analysenzeiten• präparative Trennungen:HPLC sehr leistungsfähig, trotzdem weniger verbreitet infolge hoher Investitions- und Betriebskosten (Säulen, Lösungsmittel)
- UHPLC UltrahochleistungsflüssigchromatographieUltra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC)Fa. Waters führt die UHPLC unter dem Warenzeichen UPLC® ein.Besonderheiten gegenüber HPLC• Partikelgröße der stationären Phase reduziert (< 2 µm): Sub-2-µm-Material• dadurch sehr kurze Säulen möglich (50, 100 mm)• deutlich höhere Trenngeschwindigkeit > höherer Probendurchsatz• wesentlich geringerer LM-Verbrauch (ca. 1/10; Flussrate: 0,01...1 ml/min)• allerdings: Rückdruck = 1 / d2 (d: Partikelgröße), daher Pumpen. notwendig, die mehr als 1000 bar entwickeln können• „druckfeste“ DetektorenPh.Eur. 8.3: Allgemeine Monographie „2.2.29 Flüssigchromatographie“wurde an die UHPLC angepasst.
- Gaschromatographie (GC) besondere Form der Säulenchromatographie, bei der als mobile Phase ein Gasfungiert; einsetzbar zur Trennung und qual. und quant. Bestimmung vonSubstanzen, die unzersetzt in die Dampfform übergeführt werden können, bzw.aus denen sich unzersetzt verdampfbare Derivate herstellen lassen.Verflüchtigungstemperatur 50-300°C.Fest-Gas-Chromatographie (GSC): Adsorptions-ChromatographieFlüssig-Gas-Chromatographie (GLC): Verteilungschromatographie
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- Gaschromatographie (GC) vorteile Besonderheiten infolge niedriger Viskosität der mobilen Phase:• kurze Analysenzeiten• hohe Trennschärfe• sehr geringe Substanzmengen trennbar• Substanzen im Gaszustand → hohe Diffusionsgeschwindigkeiten,daher rasche Einstellung der Gleichgewichte zwischen mobiler undstationärer Phase
- GC: Prinzipieller Geräteaufbau Probe wird mittels Injektionsspritze in den geheizten Probeneinlass eingebracht,dort verdampft sie augenblicklich und wird vom Trägergas durch die Trennsäuletransportiert. Die mit dem Trägergas in den Detektor gelangenden getrenntenSubstanzen werden vom Detektor⇒PC als Peak erfasst.
- GC: Trägergase TrägergasHe, Ar, H2, N2(wichtig!), CO2 (zunehmende Polarität) H2: niedrigste Viskosität, daher auch bei längeren Säulen optimale Strömungsgeschwindigkeit gewährleistet, jedoch Explosionsgefahr;Durchflussgeschwindigkeit: 30-80 ml/min
- GC Trennsäulen Trennsäulengepackte Säulen: Edelstahl bzw. Glassäulen, Belastbarkeit bis 10 µl Lösung;stationäre Phase ist auf Oberfläche eines inerten gekörnten Trägermaterials aufgezogen; meist 2-3 mm Durchmesser, Länge: einige mKapillarsäulen: stationäre Phase befindet sich als dünner Film an der Innenwandeiner Quarzglaskapillare; meist 0,1...1 mm Durchmesser, Länge: 30...300 mBelastbarkeit:10-1 bis 10-3 µl Lösung (spezielle Injektoren: Split)wesentlich höhere Trennstufenzahl erzielbar,wesentlich bessere Trennergebnisse• Dünnfilmkapillare: 2-3 µm dünner Film der stat. Phase• Dünnschichtkapillare: an Innenwand dünne Schicht vonmit stat. Phase belegtem Trägermaterial
- GC: Stationäre Phasen für Adsorptions-GC Adsorbentien:AktivkohleKieselgelAluminiumoxidMolekularsiebePoropak (poröses Polystyrol)Ionenaustauscher für Verteilungs-GCTrägermaterialien:KieselgelKieselgurTeflonGlaskugelnTrennflüssigkeiten:SqualanApiezonfetteSiliconölePolyethylenoxidePolyetherPolyestercyanethylierte Alkohole, Glykole
- GC: Probenaufgabe und Trennung Mit Mikroliterspritze durch ein Silikongummiseptum; muss so erfolgen, dassdie Probe spontan verdampft. Gase: 0,1...10 ml; Flüssigkeiten:gepackte Säulen: 0,1...10 µl, Kapillarsäulen um Faktor 1000 weniger;Feststoffe: nur wenn ausreichende Flüchtigkeit gegeben ist, in LM gelöst,in Injektor wie Flüssigkeit eingebracht; Derivatisierung (zu flüchtigen Derivaten) für nicht unzersetztverflüchtigbare Verbindungen notwendig!a) Acetylierung: OH, NH2, NHR, z.B. mit Acetanhydrid, Trifluoracetanhydrid(mit hochempfindlichem Elektroneneinfang-Detektor ist Fluor gut erfassbar)b) Silylierung: H in OH, NH, COOH, SH durch Trimethylsilylgruppe ersetzt(z.B. mit N,O-bis-Trimethylsilylacetamid) Trennung: isotherm (bei konstanter Temp.) oder mit programmiertemTemperaturanstieg → Temperaturgradient; Obergrenze, wenn stationärePhase zu verdampfen beginnt („Säulenbluten“ = Bleeding )
- GC-Detektor: Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD) Vergleich der Wärmeleitfähigkeit des Trägergases allein und des Trägergases, dasKomponenten der Probe enthält → Differential-Detektor. Beruht auf der Änderung desWiderstandes eines Heizdrahtes je nach Ausmaß, in dem ein ihn umgebendes Gas Wärmean die Detektorwand abtransportiert. Signal ist konzentrationsabhängig. Erfasst werden alle(auch C-freie) Verbindungen, welche die WLF des Trägergases verändern → universell
- GC-Detektor: Flammenionisationsdetektor (FID) Eluat wird in eine Wasserstoff-Flamme geleitet und dort verbrannt. Gemessen wird dieZunahme der Ionen in der Flamme dadurch, dass der zwischen 2 Elektroden fließendeStrom registriert wird. Angezeigt werden nur kohlenstoffhältige verbrennbareVerbindungen (also nicht Wasser, Edelgase, Stickstoff, CO, CO2, O2, CCl4, NH3)Das Signal ist massenstromabhängig; auch Halogen-, N-, P-selektive FIDs verfügbar
- GC-Detektor: Elektroneneinfangdetektor Electron Capture Detector (ECD)Im Detektor befindet sich ein Beta-Strahler (63Ni, 3H). Gasraum ist durch freie Elektronen leitend. Substanzen, die Elektronen einfangen können (vor allem halogenhältige) führen zur Abnahme des gemessenen Elektronenstroms → zeigt Substanzen mit hoher Elektronenaffinität an
- GC: Massenspektrometer als Detektor hochspezifisch (Kopplung on-line, heute nur mehr mit Kapillar-GC);Trägergas muss vollständig entfernt werden → leichter bei Kapillar-GCrealisierbar Aufzeichnung des Totalionenstroms (total ion current, TIC)zu jedem GC-Peak wird das entsprechende Massenspektrum erhalten(Vergleich mit Spektrenbibliotheken möglich) Bei fixer Einstellung des MS auf ein bestimmtes m/z Verhältnis→ massenspezifische Detektion, "single ion monitoring" (SIM)
- GC: Anwendungen qualitative und quantitative Analyse von Gemischen flüchtiger Verbindungen;auch wenn sehr komplexe Gemische vorliegen (z.B. ätherische Öle)wenig verbreitet: präparative GC Kopplung: Trennverfahren mit Nachweisverfahrenon-line: direkte Verbindung z.B. GC-MS, auch GC-IR (hier FT-IR)off-line (Transfer erforderlich): z.B. GC-NMR
- Supercritical Fluid Chromatography (SFC) Zwischenstellung zwischen HPLC und GCmobile Phase: überkritisches Fluid Kompression eines Gases → Verflüssigung, aber nur wenn Temperaturunterhalb der sog. kritischen Temperatur liegt. Andernfalls → Gas immerdichter und dichter (Fluid), aber keine Kondensation zu flüssiger Phase. • geringe Viskosität (ähnl. GC)• hohe Beladbarkeit (ähnl. HPLC) mobile Phase: meist überkritisches CO2, ev. mit polarem “Modifier”,z.B. MeOH (bis zu 30%); ev. + “Additiva” (geringe Mengen Säure oder Base)stat. Phase: z.B. stat. Phasen aus HPLC verwendbarPh.Eur.Methode: 2.2.45 Flüssigchromatographie mit superkritischen Phasen Kapillar-SFC: Erwartungen nicht ganz erfüllt→ zurück zur SFC in gepackten SäulenDruck mittels Restriktor bis nach dem Detektor aufrechterhalten(z.B. 30°C, 200 bar)Detektoren: modifizierte HPLC-Detektoren, ev. auch FID
- Gegenstrom-Verteilungschromatographie (Countercurrent Chromatography, CCC) Stationäre Phase ist flüssig ⇒ Verteilungschromatographie bzw.kontinuierliche Exraktion mit zwei nicht miteinander mischbarenFlüssigphasen.Variationen der CCC:Droplet Countercurrent Chromatography (DCCC): Mobile Phasepassiert die stationäre Phase in Form von TröpfchenCentrifugal Partition Chromatography (CPC): Die stationäre flüssigePhase wird durch Zentrifugalkraft fixiert ⇒ rotierende Säule, durchdie die mobile Phase gepumpt wird.High-Speed Counter-Current Chromatography (HSCCC): Diestationäre flüssige Phase befindet sich in spiralförmig aufgewickeltenKunststoffschläuchen, die in einem Exzenter-System um zweiAchsen gleichzeitig rotieren. Die mobile Phase wird langsam
- Theorie des chromatographischen Prozesses Mehrere Theorien zur Beschreibung der relevanten Vorgänge:• Kinetische Theorie• Theorie der Böden (Trennstufen-Modell)• Dynamische Theorie• Molekularstatistische Theorie (random-walk-Modell)
- Kinetische Theorie Verhalten einzelner Moleküle verschiedenen Typs wird betrachtet;Boots-Modell (verschiedene Typen von Booten auf einem Fluss) Beispiel: 3 Substanzen (I, a, b)I Inertsubstanz (ohne Retention), wandert gleich schnell wie mobile Phasea mit einer bestimmten Retentionb mit Retention größer als a (wandert langsamer als a) am Säulenkopf aufgegeben, dann LM-Gemisch zugeführt (wandert infolgeSchwerkraft durch die Säule), Subst. I, a und be werden mittransportiert undverlassen nacheinander die Säule am unteren Ende; Zeit vom Beginn der Entwicklung gemessen, Subst.-Konzentration am Endeder Trennstrecke laufend gemessen → Darstellung als zeitabhängigesKonzentrationsprofil: Elutionskurve
- Kenngrößen chromatographischer Peaks tM ... Totzeit (= Aufenthaltszeit in der mobilen Phase)tR ... Bruttoretentionszeit (= Gesamtaufenthaltszeit)tR – tM ... Nettoretentionszeit (= Aufenthaltszeit in der stationären Phase) Bezeichnungen nach IUPAC:tM ... Hold-Up-Zeit (hold-up time)tR ... Totalretentionszeit (total retention time)tR – tM ... adjustierte Retentionszeit (adjusted retention time) Wi... Peakbreite zwischen den WendepunktenWh ... Peakbreite bei halber Peakhöhe HalbwertsbreiteWb... Peakbreite zwischen den Schnittpunkten der Wendetangenten mit der Basislinie Basisbreite Wh = 1,18 Wi(bei idealer Gauss-Kurve)
- Theorie der Böden (Trennstufen-Modell) Verteilungsgleichgewicht (Substanz ↔ mobile/stationäre Phase) stellt sichnicht unendlich schnell ein. Trennstrecke wird in gedachte Abschnitte zerlegt,die gerade lang genug sind, damit Gleichgewichtseinstellung erfolgen kann.Länge so eines Abschnittes: Höhenäquivalent eines theoretischen Bodens(Begriff aus der Destillation) bzw. height equivalent to a theoretical plate(HETP) bzw. Trennstufenhöhe (H) Je kleiner die Trennstufenhöhe, umso mehr Trennstufen proTrennstreckenlänge ⇒ umso besser die Trennleistung des Systems BH=L/Z Z = 16 (tr/Wb)2 BH ....... Höhe eines theoretischen BodensL ....... Länge der chromatographischen Trennstrecke in mmZ ....... TrennstufenzahlB ....... Basisbreite eines Formeln sind exakterweise nur für Peaks mit Gauss-Form anwendbar!
- Ursachen für „nicht ideale“ Chromatographie • Viskosität der mobilen Phase• Diffusionseffekte• Streudiffusion = Eddy-Diffusion: Moleküle nehmen unterschiedliche. Wege in der Säule• Längsdiffusion: Diffusion in alle Raumrichtungen bei gleichzeitiger. Mitnahme durch die mobile Phase
- Ermittlung der Peaksymmetrie nach Ph.Eur. und USP b0.1 ...... Breite eines Peaks bei 10% der Peakhöheb0.05 ..... Breite eines Peaks bei 5% der Peakhöhe -> Ph.Eur. und USPa ......... Schnittpunkt ansteigende Kurve bis Schnittpunkt Lot im Peakmaximum bei 5% der Peakhöhe As=b0.05/2a As... Symmetriefaktor As> 1: Peak-TailingAs= 1: symmetrischer PeakAs< 1: Peak-Fronting (oder -Leading) IUPAC verwendet die Peakbreite bei 10% der Peakhöhefür die Bestimmung der Peaksymmetrie und berechnetden Quotienten der „vorderen“ und „hinteren“ halbenPeakbreiten. ->Peaksymmetriewerte nach Ph.Eur. (bzw. USP) und IUPACsind daher nicht identisch!
- Dynamische Theorie • Erweiterung der Theorie der Böden• Zusammenhang zwischen der theoretischen Trennstufenhöhe H und dynamischen Erscheinungen (Diffusions-, Strömungseffekte und Nichtgleichgewichtseinstellung): van Deemter-Gleichung
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- Dynamische Theorie • Erweiterung der Theorie der Böden• Zusammenhang zwischen der theoretischen Trennstufenhöhe Hund dynamischen Erscheinungen (Diffusions-, Strömungseffekteund Nichtgleichgewichtseinstellung): van Deemter-Gleichung A: Einfluss der Eddy-Diffusion (Streudiffusion)und der Strömungsverteilung B: Einfluss der Längsdiffusion C: Einfluss von Stoffaustauschphänomenen Stationäre Phase hat Poren, in die mobile Phase eindringen kann und „aufgehalten“wird. Moleküle können nun in die fließende mobile Phase zurückdiffundieren oder werden durch Wechselwirkung mit der stationären Phase länger fixiert. ⇒ Banden werden mit steigenderFließgeschwindigkeit breiter H = A + B/U + C * u H....Höhe des theoretischen Bodens u......lineare Strömungstheorie
- Konsequenzen aus der van Deemter-Gleichung Eine hohe Trennstufenzahl wird erreicht durch: • stationäre Phase mit enger Korngrößenverteilung,• möglichst kleiner Partikelgröße der stationären Phase,• Lösungsmittel mit geringer Viskosität,• Mobile Phase: Fließgeschwindigkeit muss genügend hoch sein, um. Längsdiffusion auszuschalten• Allerdings: Bei zu hoher Fließgeschwindigkeit sinkt die Auflösung
- Auswertung und Beurteilung von Chromatogrammen • Beurteilung der Trennleistung eines chromatograph. Systems• Qualitative Auswertung eines Chromatogramms• Quantitative Auswertung eines Chromatogramms • äußere Chromatogramme • innere Chromatogramme Äußeres Chromatogramm: entsteht erst außerhalb der Trennstrecke durch dasDetektorsignal bzw. durch die Gewinnung von Fraktionen (SC, HPLC) Inneres Chromatogramm: entsteht direkt bei der Trennung (DC, PC)
- Chromatogramm Auflösung angestrebt wird optimale Trennung (nicht unbedingt „maximale“ Trennung),nähere Definition über den Begriff der Auflösung:Auflösung A = Maßzahl dafür, wie weit die Peaks zweier Substanzen (1, 2) voneinander getrennt sind;A ist eine rechnerische Größe, aus einem äußeren Chromatogramm ermittelbar A = 2 · [(tR(2) - tR(1))/(Wb(1) + Wb(2))] tR = Gesamtretentionszeit, Wb = Basisbreite des jeweiligen Peaks A = 0 : keine TrennungA < 1 : unvollständige TrennungA = 1 : Dreiecksformen getrennt, aber infolge der Glockenform der Peaks noch teilweise ÜberlappungA = 1.5 und darüber: gute Trennung (Basislinien-Trennung)
- Eine Verbesserung der Trennung zweier Substanzen (= Vergrößerung der Auflösung) in der HPLC kann erzielt werden durch: Erhöhung der Selektivität (z.B.: andere mobile Phase) mehr Trennstufen(z.B.: kleinere Korngröße d. stat. Phase)
- Auswertung und Beurteilung von Chromatogrammen Qualitative Auswertung Anzahl der Substanzen in einem Gemisch:Anzahl der Flecken auf innerem Chrom. (DC, HPTLC)Anzahl der Peaks in äußerem Chrom. (HPLC, GC, ...) • Wanderungsverhalten der einzelnen Substanzen:RF-Wert bzw. RX-Wert bei innerem Chrom.k´-Wert bei äußerem Chrom. • Kombination mit weiterer Information aus Detektionsmethode:spezifische Nachweisreaktionen auf DC-Platte spektroskopische Information, z.B. aus Diodenarray Detektor (HPLC), Massenspektrometer (GC, HPLC),MALS-Detektor (HPLC)
- Quantitative Auswertung innerer Chromatogramme Fleckengröße (visuell): wichtig für quantitative bzw. semiquant. Auswertung, jedoch kein linearer Zusammenhang mit Substanzmenge Abhängigkeit der beobachteten Fleckengröße:• Nachweisgrenze der verwendeten Detektionsmethode • aufgetragene Substanzmenge • Laufstrecke Methoden: Semiquantitative Abschätzungdurch visuellen Vergleich der Fleckengrößen von Analyt und Vergleichslösungen (Verdünnungsreihe) mit bekannter Konz. (auf DC-Platte abwechselnd aufgetragen)Off-Line-QuantifizierungFlecken bzw. Bänder abschaben, mit LM eluieren → Photometer (UV), Polarographie, Titration, etc.in-situ-Quantifizierungohne Zerstörung der Trennschicht: Messung von Farbe, Fluoreszenz, Fluoreszenzminderung, UV-Absorption eines Flecks mittels Densitometrie
- Messprinzipien der in-situ-Quantifizierung bei inneren Chromatogrammen Messung mit Photodiode, die die DC-Platte im Raster abtastetMessung in TransmissionMessung im Durchlicht; infolge von Streueffekten gilt hier das Lambert- Beer'sche Gesetz nicht. Es muss mit Kalibrierfunktionen gearbeitet werden; nicht unter 330 nm möglich (mangelnde UV-Durchlässigkeit der Glasplatte).Messung in RemissionLicht wird in einem best. Winkel auf Schicht gestrahlt, wird dort diffus reflektiert. Man misst Intensität des reflektierten Lichtes und vergleicht Intensität an leerer Stelle der Schicht und anStelle mit Substanzfleck; empfindlicher; bis hinunter bis 220 nm Densitometrie mit (kalibriertem) Flachbett-Scannerliefert Digitalbild, das mit geeigneter Software qualitativ undquantitativ ausgewertet werden kann.Lichtquelle: Halogenlampe und UV-Lampe (254 nm).
- Quantitative Auswertung äußerer Chromatogramme Fläche unter dem Peak ist proportional der Substanzmenge, die eluiert wurde; Dagegen ist die Peakhöhe ebenso wie die Peakbreite auch abhängig von der Retentionszeit ( → Peakhöhe ist nur in bestimmten Fällen zur Quantifizierung geeignet; besser: Fläche). Ermittlung der Peakfläche:• elektronische Integration (Integrator, PC)• Ausschneiden der Peaks (aus Kopie des Chromatogramms) und Wägen → Gewicht ist proportional der Fläche• Berechnung mit Hilfe der Peakabmessungen:F = h *b0.5*1,0632
- Potentielle Verunreinigungen in der Synthese • Verwandte Substanzen: Verunreinigungen aus der Synthese (Ausgangssubstanz, Zwischenprodukte) oder Abbauprodukte (des Endprodukts oder von Zwischenprodukten)• Anorganische Verunreinigungen (aus dem Herstellungsprozess)– Reagentien, Katalysatoren, Komplexliganden– Schwermetalle– Salze– Aktivkohle, Filtrierhilfsstoffe, ...• Restlösungsmittel
- Fachbegriffe zu „Verunreinigungen“ • Identifizierte V: V. mit bekannter chemischerStruktur• Nicht identifizierte V: Strukturnachweis wurdenicht erbracht, sie ist aber durch einen analytischenParameter definiert• Spezifizierte V: einzeln aufgeführte V, durchspezifisches Akzeptanzkriterium begrenzt• Nicht spezifizierte V: durch allgemeinesAkzeptanzkriterium begrenzt, aber nicht einzelndurch ein spezifisches Akzeptanzkriterium begrenzt • Qualifizierte V: V., deren biologische Aktivität (unddamit Unbedenklichkeit) belegt ist• Erweiterte Definition:• Verwandte V. (bzw. Substanzen): V., die mit demWirkstoff verwandt sind oder ganz allgemein:organische Verunreinigungen
- Fachbegriffe zu „Grenzwerten“ • Berichtsgrenzwert (Reporting threshold, Neglecting threshold): GW, bei dessen Überschreitung eine Verunreinigung angegeben werden muss. Werte unter diesem GW bleiben unberücksichtigt.• GW für Identifizierung (Identification threshold): bei Überschreiten dieses GW muss die V. identifiziert werden• GW für Qualifizierung (Qualification threshold): bei Überschreiten dieses GW muss die V. qualifiziert werden
- Prüfung auf Reinheit in der Arzneibuchmonographie Problem: Das Verunreinigungsprofil kann sich nur auf einen bestimmten Syntheseweg beziehen. • Lösung des Problems: Transparency List• Transparency List: listet die bekannten verwandten Verunreinigungen auf, die auch durch dieMonographie-Methode selektiv erfasst werden – mit der Einführung von Generika werden alternative Synthesewege beschritten > neues Verunreinigungsprofil• die Einzelmonographie ist dann für die Reinheitsprüfung nicht mehr allein geeignet! ⇒ Hersteller muss die Zulassungsbehörde über eine sog. Änderungsanzeige informieren.
- CEP = Certificate of suitability Beleg, dass eine Monographie des Europäischen Arzneibuchs geeignet ist, die Qualität eines Arzneistoffes angemessen zu prüfen. Beispiel: Generica-Hersteller produziert Wirkstoff, für den es eine Ph.Eur.- Monographie gibt. Hersteller muss eine detaillierte Beschreibung seines Herstellungsprozesses und der Verunreinigungen in Form eines Verunreinigungsprofils bei der EDQM einreichen. Alle Verunreinigungen müssen durch Ph.Eur.-Methoden nachweisbar sein. Die Erteilung des CEP bescheinigt dem Hersteller, dass die Monographie des Ph. Eur. für die Qualitätsprüfung anwendbar ist. Ins CEP können ergänzende Prüfpunkte und Limits aufgenommen werden.
- Interner Standard eine weitere Substanz in bekannter Konz. wird dem Analysengemisch zugesetzt; Flächenverhältnis für Analysensubstanz-Peak zu Standardsubstanz-Peak separat ermitteln(in mehreren Konzentrationen) → Kalibrationsgerade Achtung! Gleiche Peakflächen unterschiedlicher Verbindungen müssen nichtgleiche Konzentration bedeuten (abhängig von Detektor!).
- Externer Standard Authentische Analysensubstanz wird in getrennten Analysenläufen in jeweils bekannter Konz. vermessen → Kalibrationsgerade hier: kein zusätzlicher Peak im Chromatogramm, aber höhere Anforderungen an Reproduzierbarkeit der Bestimmung (Probenvorbereitung, DetektorEmpfindlichkeit, Genauigkeit des injizierten Probenvolumens, usw.).
- Hydroxy(l)apatit-Chromatographie (HAC) • Hydroxy(l)apatit: Ca5(PO4)3OH• Prinzip der HAC:– Adsorption auf Basis von Komplexierung bzw.elektrostatischer WW• Aminogruppen (+): Elektrostatische WW (Attraktion) mit Phosphatgruppen (-)• Carboxygruppen (-) -> in bspw. proteinen: Elektrostatische WW (Abstossung) und Komplexierung durch die Ca2+-Ionen Zusammenfassung • Robuste, einfache Methode• Reinigungsfaktor: nur 2...5• Ausbeute: 40...60%• Für Bindung ist gewisse Zahl an Ladungenerforderlich (kleine Moleküle, AS, denaturierteProteine binden nicht!)
- Hydroxy(l)apatit-Chromatographie (HAC) Aufbringen der Probe / Elution • Basische Proteine:– Auftragung: Phosphat-Puffer 1mM– Elution: CaCl2 (MgCl2) 1...3 mM• Saure Proteine:– Auftragung: NaCl-Lsg 1mM (ungepuffert)– Elution: Phosphat-Puffer 0,1...0,3 M• Gradientenelution:– MgCl2 5mM ⇒ MgCl2 1M ⇒ Phosphat 0,3MBASISCHE P. NEUTRALE P. SAURE P.
- Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) • vor allem für Proteintrennungen eingesetzt• Prinzip– Bindung des Proteins über unpolare Regionen an hydrophobe Liganden der stationären Phasen unter hohen Salzkonzentrationen– Elution des Proteins durch Verringerung der Salzkonzentration Zugrundeliegendes Prinzip der HICHofmeister-Reihe antichaotrop chaotrop Kat. NH4+ K+ Na+ C(NH2)3+ Guanidin Ani. PO4 SO4 CH3COO- Cl- Br- NO2 - ClO3- I- SCN- Hydrophobe Effekte ⇑ Hydrophobe Effekte ⇓ Proteinaggregation ⇑ Proteine in Lösung ⇑ Die Hofmeisterreihe ist auch Grundlage für dasAussalzen von Proteinen (v.a. Ammonsulfat verwendet). Trenneffekt v.a. bei der Adsorption, weniger bei der Desorption!• Stationäre Phase: Synthetische oder Bio-Polymere mit hydrophoben Liganden (Phenyl-, Octylsepharose)• Mobile Phase: am häufigsten (NH4)2SO4 1...2,5 M, ev. Additive: Methanol, Ethylenglykol, Detergentien Zusammenfassung • Reinigungsfaktor: 5...20• Ausbeute: 10...40%• Stationäre Phase– Phenylsepharose: weniger hydrophob, mildereBedingungen bei der Elution– Octylsepharose: für schwach hydrophobe Proteine,Membranproteine
- Hydrophobe Interaktionschromatographie Durchführung • Auftragen der Probe– in hoher Ionenstärke• Waschen der Säule• Elution – mit abnehmendem Salzgradienten – mit niedriger Salzkonzentration – mit Seifenlösungen