Biotechnologie (Fach) / VL 7: Downstream-Processing (Lektion)
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Diese Lektion wurde von MiriWieni erstellt.
- Downstream Processing Def alle Verfahren, die zur Abtrennung und Reinigung von Fermentationsprodukten aus einer Fermentationsbrühe eines biotechnologischen Prozesses abgewandt werden
- 3 Nachteile der biotechnologischen Produktion -begrenzer Temperaturbereich Einsatz Biokatalysatoren (Enzyme, Pro- und Eucaryoten) -Reaktionen nur in verdünnten wässrigen Systemen -aufwendiger Prozess: muss sich über Gesamtprozess erstrecken
- Optimierung Gesamtprozess 4 Komponenten -Medienvorbereitung -Sterilfiltration -Abwasserproblem -Produktaufarbeitung: Kosten bis zu 50 % Gesamtproduktion
- Beschränkungen beim Produktionsstamm 9 Bedarf Nährstoffbedarf -02 und Co2 Anforderungen -Scherempfindlichkeit -Temperaturoptima Merkmale: -Morphologie -Viskosität -Genstabilität SW -metabol. Kontrolle -Nebenprodukte
- Medien -Komponenten 6 -Beschränkungen 4 Komponenten: Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Schwefel, Spurenelemente, Wasser etc. Beschränkungen: Verfügbarkeit, Stabilität, Vorbehandlung, Sterilisation
- Produktionsparameter 5 -Wachstum Suspension / Trägermaterialien -Fermentertyp -Rührtechnik -Arbeitsvolumen, Geometrie -Betriebsparamter, Automatisierung
- 3 Komponenten Upstream-Processing -Produktionsparameter wie pH, Saerstoff, Schaummittel, Kühlen/Heizen -Vorzuchtkultur -Medienentwicklung
- Downstream Processing -2 Einflussfaktoren -3 Abwägungen -Produktkonzentration und Stabilität -Abwägungen: Ausbeute, Prozesskosten, Reinheit
- 5 Schritte Downstream-Processing -Zellabtrennung -Zellaufschluss -Produktgewinn und Konzentrierung -Produktreinigung -Konfektionierung
- 2 Verfahren zur Zellernte -Zentrifugation -Filtration
- Zentrifugation -Gesetz und Konsequenzen -Modelle 2 -Stoksches Gesetz: Geschwindigkeit sollte möglichst hoch sein -Tellerseperatoren: am häufigsten -Dekanter: Aufkonzentrierung geflockter Suspensionen
- Filtration Def Vorrausetzung Lage -Abtrennung von Partikeln aus fluider Phase mittels einem porösem Gebilde -hohe Zelldichte -orthogonal zum Stützmaterial
- Filtration oder Zentrifugation wählen? Filtration ist Zentrifugation überlegen, wenn geringer Dichteunterschied zwischen Schwebstoffen und flüssiger Phase
- 3 Filtrationsarten -Siebfiltration -Oberflächenfiltration -Tiefenfiltration
- Siebfiltration -Prinzip - -Rückhaltung durch Sieb -Abscheidung geringer Partikelmengen; Vorfiltration
- Oberflächenfiltration -Stützmaterial hält Filterhilfsmittel zurück => dieses übernimmt dann Filterfunktion -Trüblauf Anfahrphase bzw. batch Betrieb, hier Zunahme Druck bei konstantem Fluss
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- Tiefenfiltration -Anwendungsbereich -2 Schritte -Abtrennung kleiner bis mittlerer Partikel; geringe Partikelkonz Ablauf: -kugelförmige Partikel werden auf Stützmaterial als Filterhilfsmittel angeschwämmt -kleinere Partikel lagern sich in Hohlräume
- Zellaufschluss -Sinn -2 Faktoren bei Verfahrensauswahl zu berücksichtigen -Gewinnung intrazellulärer Produkte -Wirkschaftlichkeit -bioaktive Produkte d.h. möglichst geringer Aktivitätsverlust
- 3 mechanische Verfahren Zellaufschluss -Ultraschall -Mahlen mit Kugelmühlen -Hochdruckhomogenisatoren
- physikochemische Verfahren zum Zellaufschluss 4 -osmotischer Druck -Gefrieren/Auftauen -Gefriertrocknung -Lösungsmittel, Säuren, Basen, Reagenzien
- biologische Verfahren Zellaufschluss 4 -Viren -Phagen -Antibiotika -lytische Enzyme
- Rührwerkskugelmühlen -Funktionsprinzip -Aufbauarten 1) im Inneren eines horizontal gelagerten, rotierenden Hohlkörpers: Mahlkörper werden durch Reibungs- und Trägheitskräfte auf bestimmte Höhe mitgenommen und prallen auf das Gut 2) -schnell laufende Rührwerke vertikal/horizontal -Antriebswellen zentrisch/exzentrisch
- Hochdruckhomogenisatoren -Einsatz -Verfahrensvarianten -Ventile -Einsatz: v.a. Flüssigkeiten homogenisieren, auch Zellaufschluss -Variante: Stauaufschluss -Flach- und Kegelventil
- Wie wird was aufgeschlossen? -Muskelgewebe: Fleischwolf -Pflanzen: Zermahlen N2, Messerhomogenisator -Zellen höherer Eucaryoten: Osmolyse -Bakterien gramnegativ: Glaskugeln, Einfrieren-Auftauen, Ultraschall -Bakterien grampositiv: Lysozym, EDTA, French Press -Hefen: Autolyse
- 5 Regeln zur Aufreinigung von Enzymen -kühl und zügig arbeiten -schnelle Zugabe Protease-Inhibitoren (Gefahr enzymatischer Abbau) -Kontakt mit Metall vermeiden (Abgabe Schwermetall) -Minimierung Sauerstoffkontakt (nicht zu stark schütteln, Zugabe Reduktionsmittel) -keine zu starke Verdünnung Reduktionsmittel (Aktivtätsverlust, Oberflächenabsorption)
- Präzipation Def Makromoleküle zb Proteine werden durch geeignete Methoden aus Lösung in Partikel überführt und sedimentieren
- Präzipitation -Bedeutung -Verfahren -Selektivität Bedeutung: meist erster Schritt Proteinreinigung im großtechnischen Maßstab, hohe Aufreinigung durch Kombi Fällung und Chromatographie Verfahren: -Zusatz Salze, organische Lösemittel, wasserlösliche Polymere -Veränderung pH und Temperatur -meist unselektiv
- Aussalzen -Grundprinzip -zwei Arten -bevorzugtes Mittel Verdrängung von Stoffen durch Salzzugabe -niedrige Ionenstärke: Einsalzeffekt bessere Löslichkeit -höhere Ionenstärke: Aussalzeffekt Proteinlöslichkeit hat bei einer best. Salzkonz Optimum -Ammoniumsulfat: billig, stabilisierend, bei hohen pH Ammoniak
- Präzipation durch organische Lösemittel -Effekt -Lösemittel -Temperaturen -2 Bsp -Verminderung der Löslichkeit -Lösemittel Ethanol, Polyethylenglykol, Isopropanol, Aceton -Fällung bei niedrigen Temperaturen -Ethanol Fraktionierung; Invertase Aceton
- 3 weitere Fällungsmethoden -Ausfällung isoelektrischer Punkt -Hitzebehandlung -Kyropräzipation
- Ausfällen am IP -Vorteile -Ablauf -Unterstützung -einfach, billig -Mineralsäuren pH-Einstellung, kontrolliert -Unterstützung Zugabe organischer Lösemittel
- Fällung durch Hitze Anwendung bei thermostabilen Proteinen
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- Kryopräzipation Def Anwendung -Ausfällung Gefrierpunkt -nur Fraktionierung Blutproteine
- 4 Membranverfahren Druckdifferenz, Porengröße, Anwendung -Mikrofiltration: Druckdiff unter 2 bar, dabei sind Poren über 50 nm Anwendung: Biomasse-Rückhalt -Ultrafiltration: Druckdiff 2-10 bar, 5-50 nm, Entfernung niedermolekularer Stoffe; Konzentrierung -Nanofiltration: Druckdifferenz 5-20 bar, 5-0,5 nm, Abtrennung organischer Komponenten, Salze -Umkehrosmose: Druckdiff 10-200 bar, Lösungsdiffusion, Entf. niedermolekularer Stoffe
- Elektrophorese Ablauf -Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld -Auftrennung in einzelne Zonen
- Elektrophorese -mehrere Verfahren -Anwendungen Verfahren: -Zonenelektrophorese homogenes Puffersystem -isoelektrische Fokussierung pH-Gradient Anwendung: -etabliert Biochemie, Molekularbiologie -analytisch und präperativ
- Chromatographische Trennmethoden 5 -Moleküleigenschaften -Trennmethoden -Größe, Form: Ausschluss -Ladung: Ionenaustausch -Hydrophobizität: hydrophobe Interaktion -Biospezifität: Affinität -Komplexierung: Metallchelate
- Ionenaustauschchromatographie -Bedeutung -Wirkprinzip Bedeutung: am häufigsten eingesetzt, 1. Schritt Proteinreinigung Wirkprinzip: kompetivite Wechselwirkung von Ionen; Probe konkurriert mit Salzionen um Position in Matrix
- Normalphasen-Chromatographie stat. und mobile Phase Probleme -polare stationäre Phase: Papier, Cellulose, Kieselgele -unpolare mobile Phase: organische Lösemittel niedriger Polarität oft Probleme, Störung des chromatographischen Prozesses
- Umkehrphasen-Systeme -Phasen -Ablauf -Eluent -unpolare stationäre Phase: Derivatisierung mit langen Kohlenstoffketten -polare mobile Phase -hydrophobe WW mit stationärer Phase -Eluent unpolar, konkurriert mit Analyt um Bindestellen
- Form der RP-Chromatographie: Zugabe Ionenpaar-Reagenz -Prinzip -Beispiel -Entwicklung – Bindet mit einem geladenen und einem ungeladenen Molekül-Teil als Gegenion an die ionischen Seitengruppen des Analyten und verändert dessen Polarität – Entstandener Ionenpaar-Komplex zeigt ein anderes chromatographisches Verhalten als der native Analyt Beispiel: Trennung von Peptiden, Zugabe von Trifluoressigsäure • Anwendung der RP-Chromatographie eng verknüpft mit Entwicklung der HPLC (HighPerformance Liquid Chromatography)
- Reversed-Phase-Chromatographie -Anwendung -2 Betriebsweisen -Methode für Peptide, Probleme mit viel organischem Lösemittel isokratisch: gleiche Zusammensetzung mobile Phase Gradientenelution: steigender organischer Anteil
- Affinitätschromatographie Prinzip 3 Schritte -spezifische und reversible Absorption eines Moleküls an matrixgebundenen Partner 1. Affiner Partner wird an Matrix gebunden => immobilisierter Ligand 2. selektive Absorption Partner aus komplexer Mischung 3. Desorption durch kompetitive Verdrängung / Konformationwechsel pH etc.
- 2 Arten Affinitätschromatographie -monospezifisch: Bindung auschließlich an definiertem Bindungspaar Bsp. Hormon und Rezeptor -gruppenspezifisch: alle ähnlichen Proteine aus einer Klasse binden an Affinitätsmatrix Bsp Lectin Concavalin A an Mannose und Glucosehaltige Komponenten
- Aminosäureanalyse 2 Schritte Was passiert mit welchen AS? 1. Hydrolyse des Proteins 2. Trennung, Detektion, Quantifizierung
- Aminosäurenanalyse Was passiert mit welchen AS bei Hydrolyse? -Tryptophan zerstört -Verluste Serin, Theorin, Methionin, Cystein -Aspargin und Glutamin in Säuren
- Aminosäureanalyse: Trennung, Quantifizierung, Detektion 2 Methoden -Ionenaustauschchromatographie, gefolgt von Derivatisierung Ninhydrin -Vorsäulenderivatisierung mit Reagentien
- 3 Arten der chemischen Spaltung von Proteinen -saure Hydrolyse mit Salzsäure -saure Hydrolyse mit organischen Säuren -alkalische Hydrolyse mit Ba (0H)2
- chemische Spaltung 3 Arten der gezielten Spaltung -milde Säurehydrolyse Ser und Ther-Bindungen geringe Bedeutung - Bromcyan: Met-Bindungen sehr spezifisch -Reaktion mit N-Brom succinimid: Spaltung an Trp
- Proteinsequenzanalyse -Totalhydrolyse -Methode Ablauf Gerät -Totalhydrolyse liefert keine Infos -Edmann-Abbau: N-terminale Sequenzierung mit Phenylisothiocyanat zyklischer Prozess: bei jedem Reaktionszyklus wird eine Aminosäure abgespalten und identifiziert empflindliche Detektion Proteinsequenzierter
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