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MPP Pr (Fach) / MPP Praktikum (Lektion)

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• Zeichnen und bennenen Sie die Strukturformel des Spaltprodukts der β-Amylase. Wie unterscheidet sich bei -αAmylase in ihrer katalytischen Wirkungsweise? Spaltprodukt Maltose (2 mal Glucose aneinander)- β-Amylase spaltet die α-1,4-gylkosidische Bindung der Stärke in Disaccharide, immer am Ketten-Ende wird das Disaccharid Maltose abgespalten- α-Amylase spalten α-1,4-glykosidische Bindungen der Stärke in Ologosaccharide, irgendwo innerhalb der Kette unspezifisch
• Wie sind passiver, primäre aktiver und sekundär aktiver Transport definiert? passiv: mit dem Konzentrationsgradienten.  Diffusion zum Konzentrationsausgleichaktiv: gegen den Konzgradienten, unter Energieverbrauch; unidirketionalprimär: Transport von anorgansichen Ionen. Direkter Transport.            Bsp Na+ - K+ Pumpe. 3Na+ raus und 3K+ reinsekundär: Transport von Metaboliten (wie Glucose), nicht direkter Transport, sondern Cotransport(Symport) z.B über aufgebauten Konzgradienten von Na+ bei NaKPumpe
• Was ist ein Proteasom? Wo ist es innerhalb der Zelle lokalisiert? Wie kann das Proteasom zur Regulation eines Signaltransduktionsweges beitragen? Proteasom = Protease; Bestandteil der Proteinqualitätskontrolle und baut Proteine zu Fragmenten ab.Proteas = Proteinkomplex das im Zytoplasma und im Zellkern vorkommt und ubiquitinierte Proteine abbautkann Signalweg unterbrechen, wenn es ubiquitinierte Proteine abbaut
• Sie untersuchen mit dem konfokaten Laserscanningmikroskop eine Gewebeprobe, die mit den Fluoreszenzfarbstoffen Cy3 und Propidiumiodid gefärbt sind. Bei Ihrem konfokalen Mikroskop haben sie folgende Laser zur Verfügung, die sie frei wählen können, um damit ihre Probe zu scannen: 402nm, 458nm, 514nm, 543nm, 633nm, Wählen Sie den/die Laser aus, den/die sie idealer Weise für beide Fluoreszenzmarker verwenden und begründen sie kurz ihre Antwort. Welche Eigenschaft muss der Strahteiler des Mikroskops besitzen, damit sie diese Aufnahme ausführen können? Annahme Cy 3 Anregungslicht bei ca 450 nm. Propiduimiodid ca 500nm-550nmWir im Praktikum haben Cy2 also Cyanin Dye genommen, das ein Anregungslicht bei 450 nm hat. Deswegen den Laser 458. llila 380-450blau 450-500grün 500-560gelb 560-600orange 600-650rot 650-750 Strahlteiler: dichroischer Spiegel. reflektiert das Anregungslicht und lässt die emittierte Frluoreszenz durch
• Welchers organische Augangsmaterilen wird bei a, Southernblot b, Northernblot bzw c, Westernblotanalysen auf entsprechende Membranen transferiert? Beschreiben Sie jeweils kurz das jeweilige Funktionsprinzip. a, Southern-Blot: DNA -> Gelelektrophorese mit Agarosegel -> dann Fixierung auf Nitrozellulose odr PVDF-Membran (+gelade, DNA -),über Kapillarkräfte ->  Membran absättigen (blockieren, um unspez Bindungen zu verhindern) und dann mit DNA Sonde markieren: radioakt od fluormark komplementärer Einzelstrang zur gesuchten DNA (Sonden bleiben nur an gesuchter Sequenz haften -> Hybridisierung) b, Norhtern-Blot: RNA -> läuft wie Southernblot, nur eben mit RNA Sonde c, Westernblot: Proteine -> Gelelektrophorese mit Acrylamidgel (SDS-Page) -> Übertragung auf Nitrozellulose oder PVDF Membran über Anlegen einer El Spannung, senkrecht zum Gel -> Auch Membran absättigen, markieren mit AK oder kurz: Erst das Ausgangsmaterial über Gelelektrophorese getrennt. Anschließend auf eine Membran übertragen (meist Nitrozellulose) und da fixiert. Freie Bindestellen der Membran absättigen. Dann Behandlung der Membran mit radioaktivmarkierter Sonde (DNA und RNA) oder AK (Immunfärbung bei Proteinen).
• Sie haben im Kurs einen Saccharosetransporter in den Geleitzellen von Wegerich lokalisiert. Welche Funktion übernimmt dieses Protein hier? Wie sind Source und Sink Gewebe definiert? Wodurch unterscheiden sich Beladungs- und Transportphloen hinsichtlich der Anatomie der Zellen? Welche Transportform des assimilierten Kohlenstoffs findet man außer Saccharose noch im Phloemsaft Höherer Pflanzen? Warum findet man keine Glucose? Funktion: direkter SUC Transport ohne Spaltung (wie bei Invertase), Versorgt Sinkgewebe mit SUC; der Transport treibt über osmotischen Druck den Phloentransport an -> DruckstromtheorieSource und Sinkgewebe: Source = Gewebe, die photosynthetisch erzeugte Assimilate exportieren, erzeugen mehr, als sie benötigne z.B. ausgewachsene Blätter -> Transport zu Sink GewebenSink = Gewebe die Assimilate importieren, weil sie mehr Assimilate für ihren Stoffwechsel benötigen, als sie erzeigtn z.B. junge BlätterAnatomie: Beladungsphloem -> große Geleitzellen, kleine Siebzellen                 Transportphloen -> große Siebzellen, kleine GeleitzellenKohlenstofftransport: Apoplast hat nur Saccharose (Apoplast = zusammenhängendes System von pflanzlichen Zellwänden und Interzellularen -> tot)Symplast hat auch Raffinose, Stachyose (Symplast = Gesamtheit der durch Plasmodesmata verbundenen Protoplasten lebender Zellen -> lebend)Glucose ist zu reaktiv -> reaktive Aldehydgruppe (würde RedOx auslösen) und zu instabil, würde in lineare Form übergehen; Außerdem nicht so gut wasserlöslich wie SUC weil hydorphober
• Vervollständigen Sie die folgenden Anreicherungstabelle, indem Sie die fehlenden Werte berechnen. Erklären sie Ausbeute und Anreicherung Tabelle: Vol[ml] Protkonz[mg/ml] Gesprot[mg] Akt[U/ml] Gesakt[U]spezAkt[U/mg] Ausb[%]Anrf R D (denk dir irgendwelche Zehlen iwo aus und Berechne den Rest) Protkonz = Gesprot/Vol  -> Umkehrschluss klar Gesprot und Vol berechnenAktivität = Gesakt/Vol -> Umkehrschluss....spez Akt= Gesakt/Gesprot -> Umkehrschluss...Ausbeute im Bezug auf Gesakt (als von KontrolleR und D) -> U von Dx100 / U von R ->%vonDAnr im Bez auf spez Akt -> genauso wie bei Ausb nur eben für Spalte spez AktAusbeute = Maß für den AktivitätsverlustAnreicherung = Anstieg der spez Akt( spez Akt = Maß für Reinheit, Gesakt = Menge an aktivem Protein pro Fraktion)
• Wie müssten Sie die Gensequenz der Invertase verändern, damit das gebildete Protein nicht mehr aus der Zelle sekretiert wird? Nennen Sie zwei Möglichkeiten und erklären Sie warum das entsprechend veränderte Protein nicht mehr ausgeschleust werden würde. Wie müssten Sie die Seuqenz verändern, damit das gebildete Protein mit Hilfe von Streptavidin/Myc-spezifischem Antikörper nachgewiesen werden könnte? nicht mehr sekretiert:- Mutation im ersten Startcodon ATG -> Signlasequenz für den Transport (20AS) würde fehlen- Frameshift Mutation, damit Protein falsch gefaltet ist und durhc Calnexin Bindung nicht mehr exportiert werden kann (korrekt gefaltete Prot werden nicht direkt glucosyliert; Falsch gefaltete werden durch glucosyltransferasen direkt glucosyliert; Calnexin bindet glucosylierte Proteine und verhindert Export)- Mtation die zu vorzeitigem Stopcodon od frameshift führen würde -> falsch faltung etc(- Anbringen einer KDEL Sequenz -> bleibt im ER c terminal)Nachweis: Streptavidin erkennt Biotinbiotinylierung dess Proteins durch Anhängen eines Biotin-His6-Tag (=Biotinsequenz)
• Erklären Sie die Funktionsweise eines Proportionalitätszählers zur Messung von Radioaktivität. Eräutern Sie auf Grundlage des Messmechanismus Vorteil und Nachteil gegenüber einem Geiger-MüllerZähler. Geiger Müller / ProportionalzählerDas Zählrohr derer besteht aus einem Metallzylinder = Kathode, mit einem an den Enden isolierten Draht in der Achse = Anode. In der Messkammer befindet sich Messgas z.B. Mehan. Durch die Wellen- bzw Teilchenemission durch die Strahlenquelle kommt es zu Primärionisation. Die so angeregnten Teilchen (Messgasionen und Elektronen), werden in dem stakren el Feld im Zylinder derart bescheunigt, dass es zur Sekundärionisation ausreicht. -> Ionisationslawine ruft momentanen Stromstoß hervor.Propzähler: 250 -500V = Proportionalitätsbereich                    Nachteil: geringere Ionisationslawine -> geringere Empfindlichkeit                    Vorteil: Verstärkung proportional zu Zählerspannung und abhängig von Art und                                  Energie des gemessenen Teilchens (Aussage über art der Strahlung)Geiger-M: 750-100V = Auslösebereich                  Vorteil: größere Ionisationslawine -> größere Empfindlichkeit                  Nachteil: unabhängig von Art des Teilchens; durch Ionis.lawine ungenaue Messung
• Allgemein: Wechselwirkung von radioaktiver Strahlung mit Materie. Wie reagieren Teilchen, Anregung, Ionisation; Messmöglichkeiten; Röntgenstrahlung Radakt Strahlung stößst beim durchgang durch Materie mit deren Atomen zusammen, nur auf Elhülle. Atom wird angeregt oder bei hochen Strahlung ionisiert. Anregung: El der Ausenhülle werden auf höhere En Niveaus gehoben -> für kurze Zeit entsteht ein energiereicher Zustand, der unter Abgabe von En wieder in urspr Zst zurück geht. Energie kann dabi z.B. in Form von Licht abgegeben werden -> SzintillationszählerIonisation: völlige Abspaltung von Außenel. Messung mit Ionisationskammern, durch Ionisation best Gase -> Proportionalzähler und Geiger-Müller-ZählerHochen β-Strahlung führt in Materialien mit hoher Ordnungszahl (wie Beil) durch Abbremsen zu Brems- bzw Röntgenstrhlnung. (zur Erzeugung: aus Glühkatode im Hochvakuum bei hoher Temp: el emittiert und durch el feld zur anode beschleunigt, dann Abbremsen im Anodenmaterial z.b Wolfram)(Autoradiographie: wenn rad Str auf chem Bindungen wie Silberbromid Ag+Br- treffen-> spaltung in Brom und Slber)
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• Szintillationszähler Gläschen -> Radakt Probe + PPO + Lsgmittel (z.b. Toluol)Bei radakt Zerfall des Isotops wird freiwerdende En auf Lsgmittel übertragen. Angeregtes Toluol gibt en weiter an Szintillator = PPO. Der wird angeregt und beim Zurückfallen in stabile Form wird En in form von Wellenlängen λ abgegeben. Die werden von einem Photonendetektor registriert und durch einen Photomultipiler verstärkt zu einem Impuls, der von der Elektronik als Einzelimpuls registriert wird. Lichtintensität ist abhängig davon wie energieschwach bze stark die Strahlung des Isotops ist (es lassen sich also aussagen über die Teilchen machen)
• Sie willen ein Gen X untersuchen und stellen dazu folgendes Konstrukt her, um damit Arabidopsis Pflanzen zu transformieren LB - 35S Promotor - BAR-Gen - Terminator - Promotor X - GFP - Terminator - RB Beschreiben sie die Funktion kedes einzelnen der acht Elemente. Was lernen sie über das Gen K wenn sie diese Pflanze untersuchen? LB und RB flankieren T-DNA die aus Agrobakteriengenom in die Pflanzenzelle eingeschleust werden ( je 25bp)35S- Promotor: aus Blumenkohlmosaikvirus. sehr stakr->überexpression. ubiquität exprimiert. konstitutiv aktiv (in jeder Pflanze)BAR-Gen: für Resistenz gegen Gluphosinate wie Phosphinotricin (ermitteln der Transpflanze)Terminator: beendet die Transkription -> trennt Bar Gen von GFP in diesem FallPromotor X: Promotor des zu untersuchenden GensGFP: Markerprotein bzw Reporterprotein; ist hinter PromotorX geschalten und damit leuchtet das Genprodukt von Gen X wegen Reportergen GFPWir lernen über das Gen: subzelluläre Lokalisation (v.a durhc GFP)
• Für welches Gen codiert das bar-Gen? Gegen welche Substanzklasse vermittelt es Resistenz (keine Trivialnamen)? Welches Enzym hemmt es und warum? Warum führt diese Hemmung zum Tod der Pflanze? codiert für: Phosphinotricin Acetyltransferase (PAT)Resistenz gegen Gluphosinate wie Phosphinotricin (BASTA...)Gluphosinate sind Glutamat-Analoga -> hemmen Glutaminsynthethase-> Tod durch Pflanze durch Ansammlung von Ammonium (NH4+; weil keine Fixierung)
• Sie sollen 10 ml einer Proteinlösung, die in 100mM Kochsalz vorliegt, durch Dialyse entsalzen. Entfernen Sie mehr Salz, wenn sie einmal gegen 10 Liter oder zehm mal gegen 1 Liter Wasser (jeweils bis zum Konzentrationsausgleich) dialysieren oder haben beide Behandlungen den gleichen Effekt? Begründung 10 mal gegen 1. Weil jedes mal neu verdünnt wird. Potenzen addieren sich.
• Bei einer Präparation genomischer DNA aus zwei verschiedenen Arabidopsis-Pflanzen (Wildtyp und transgene Pflanze mit Fremdgen A) haben sie vergessen, die Reaktionsgefäße zu beschriften. - Nennen Sie zwei Methoden, mit denen Sie herausfinden können, welche DNA sich in welchem Gefäß befindet, wenn Ihnen die Sequenz des Gens A bekannt ist - Nennen Sie zwei Methoden, mit denen Sie untersuchen können, ob die RNA des Fremdgens in der transgenen Pflanze hergestellt wird. - Woran kann es liegen, dass ein Fremdgen nicht exprimiert wird, das unter der Kontrolle des 35S-Promotors in das Genom einer Pflanze integriert hat? -Welch zwei Eigenschaften dess 35S-Promotors achen ihn zu einem der meist verwendeten Promotoren in der Pflanzenzellbiologie? - Aus welchem Genom stammt der 35S-Promotor urspünglich? - PCR von dem Gen machen und dann Restriktionsverdau mit Enzym, das nur im transgen schneidet -> bei Fremdgen A zwei Banden; Southernblot mit Sonde bei transgen- RT-PCR, cDNA sequenzieren; Nothern Blot mit Sonde bei transgen- kann möglicherweise nicht exprimiert werden wenn danach PTGS (post transkr gen silencing)- ubiquitär und konsitutiv aktiv ( Überexpression; geringe Gewebsspezifischkeit -> kann eig überall exprimieren)- aus Blumenkohlmosaikvirus
• Sie verfüttern eine radioaktive Substanz an eine Hefekultur und messen zeitabhängig die Radioaktivität in den Zellen. Sie erhalten folgende Grafik (Klausur 2004 Frage 2) Radiaktivität gegen Zeit. Erst unten flach, dann steiler Anstieg und dann wieder abgeflachter (ganz geringer Anstieg) der Radioakt. Interpretieren Sie den Kurvenverlauf Anfangs sist das Transportsystem noch nicht induziert; Dereprimierung der Invertase: Die Glucose-Transporter müssen erst noch gebildet werden. Wenn die Zahl der Trasnporter steigt, stegt auch die Menge der transportierten Glucose und damit die Radioaktovität linear an. Ab einem bestimmten Zeitpunkt (Knick), ist eine Glucose-Sättigung erreicht. Der Geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist der Umsatz durch die Invertase, die im Vergleich zum Transportsystem langsamer arbeitet. (mehr Transporter passen außerdem iwann auch nicht mehr auf die Membran)Das alles in der Annahme, dass die radakt Substanz verstoffwechselt werden kann. Wenn nicht, dann würde oben nach Aufnahme auch ein Plateau entstehen. (das nur als Hinweis)
• Kombinnieren Sie aus den unten angegebenen Bestandteilen die DNA-Konstrukte, die Sie benätigen um a den Expressionsort des Arab. Thal Gens X b die intrazelluläre Lokalisierung des Genproduktes des Genx X nach transienter Expression in Zwiebelepidermis untersuchen zu können. Skizzieren sie die beiden fertigen Konstrukte. (Bild Kl 2004 Fr 3) ATG Gen A TAG ; ATG GUS TAG; 35SPromotor Gen A TAG; GUsS TAG; GUS Promotor ATG Gen A; ATG GUS; Promotor von Gen A Skizzieren Sie ein DNA-Konstrukt, mit dem Sie nach stabiler Transformation bon A. th. Pflanzen die intrazelluläre Lokalisierung dess Genprodukts des Gens X in den Zellen bestimmen können, in denen das Gen X aktiv ist. Begründen Sie kurz die Auswahl ihres Genkonstruktes. a Expressionsort Gen X: Promotor A / GUS TAGb Lok des Genpr nach transienter Espr in Zwiebel: 35S Promotor / ATG Gen A / GUS TAGc, Lok des  Genpr nach stabiler Transf in A th: Promotor A / ATG Gen A/ GUS TAg
• Welche Typen von Restriktionsenzymen gibt es? Definieren Sie die verschiedenen Typen bezügliche ihrer Bindestelle und Schnittstelle. Welcher Typ bestitzt neben seiner Endonukleaseaktivität auch eine Methylaseaktivitätß Welche der beiden Aktivitäten ist in Abhängigkeit von Methylierungszustand der DNa jeweils wirksam? Was sind Isoschizomere? Typ I: schneiten DNA an zufälliger Stelle weit weg von Erkennungssequenz; beötigt ATP          transferiert eine Methylgruppe von S-Adenosly-MethioninTyp II: schneidet die DNA innerhalb oder in unmitelbarer Nähe der Erkennungssequenz;keinATP           keine Methyltransferase-AktivitätTyp III: schneidet DNA ca 20 - 25 bp von Erksequ entfernt; ATP und MethylaseaktTyp IV: schneidet nur methylierte/hydroxymethylierte/glucosyl-hydroxymethylierte DNA (Typ1-3             werden durch Methylierungsmuster gehemmt)-> Typ I und III auch Methylaseaktivitätsticky und blunt ends möglich- (?) Endonuklease (innerhalb DNA) Exonuklease (DNA am terminalen Ende wird gespalten)- Isoschizomere: aus verschiedenen Organismen, ernennen und schneiden aber gleich
• Sie wollen aus einer Plasmid-DNA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI ein Fragment herausschneiden. Folgende Komponenten stehen Ihnen zur Verfügung: 5 x Puffer Wasser DNA gelöst in Wasser (Konz: 2,5 μg/μl) EcoRI in Glyerin (10U/μl) BamHI in Glycerin (10U/μl) Im welchem Volumina müssen Sie dei Komponenten hinzugeben, um in einem 10μl-Ansatz 5μg DNA in einer Stunde zu schneide? Wie ist ein U eines Restriktionsenzyms definiert? 1 eines Restenz schneidet 1μg DNA in 1hDNA: 5μg sollen in 1h verdaut werden; Konz= 2,5 μg/μl5μg / 2,5μg/μl = 2μl DNAResenz: für 5μg DNA in 1h -> 5 U Enzym; wir haben 10 -> Dreisatz10 U = 1μg; 5U=?μg -> 5*1/10 = 0,5 μg von EcoRI und BamHIPuffer: wir haben 5x und wollen 1x Pufferv1 * c1 = v2 *c2  ->  10μl Ansatz * 1 = ? * 5 -> 10μl*1/5 = 2μl PufferRest Wasser: 10μl -2μl DNA - 0,5v EcoRI - 0,5 μl BamHI - 2μl Puffer = 5μl Wasser
• Sie haben 600 OD Hefezellen geerntet und in 300 ml gucosearmes-Medium aufgenommen. Von diesen 300ml haben Sie nach 30 min 200 μl für eine Messung der Invertaseaktivität entnommen. Dazu haben Sie die entnommenen Zellen nach mehreren Waschschritten in 400μl Substrat aufgenommen und für 15min vei 37°C inkubiert. Nach Denaturierung der Invertse bei 95°C haben Sie schließlich mit Hilfe des Hexokinasetests die durch die Invertaseaktivität gebildete Glucosemenge bestimmt. Hierzu haben Sie 10 μl aus dem Zellüberstand nach der Inkubation mit Saccharose zu 990 μl Wasser gegeben und schließlich 100μl davon zu 1ml Testreagenz pipettiert. Nach Messung der Extinktion von NADPH bei 340nm gegen den Leerwert, konnten Sie mit Hilfe der Eichgerade die Glucosemenge bestimmen. Diese betrug 1,8 μg. Berechnen Sie die Invertaseaktivität (in units) pro 1OD Hefezelle. Geben Sie übersichtlich alle vor der Messung gemachten Verdünnungen in Einzelschritten an (1U ist definiert als die Enzymmenge, die bei 37°C 1μmol Glucose (MW 180g/mol) pro min aus Saccharose freisetzt) 600 OD Zellen in 300 ml -> davo nur 200μl entnommen-> 600OD = 300 ml; ?OD = 200μl (0,2ml) -> 0,2*600/300 = 0,4 OD0,4 OD in 200μl -> in 400μl aufgenommen-> 0,4 OD = 400 μldavon 10 μl entnommen-> 0,4 OD = 400μl -> 0,1OD = 100μl -> 0,01 OD =10μl0,01 OD 10μl mit 990 μl Wasser -> 0,01 OD = 1mlDavon 100μl vermessen -> 0,01OD = 1ml; 0,001 OD = 100μl (die 1ml Testreagenz zählen nicht als verdünnung)---> also ende: 0,001 ODBerechnung der Invertaseakt pro 1OD in U (verdfaktor: ges 1OD, haben 0,001OD ->1000)U = Glucosemenge [μg]*Verdünnungsfaktor / MWGlucose*InkubationszeitU = 1,8μl*1000 / 180g/mol * 15min = 0,67 U
• Der Begriff der spezifischen Aktivität wird sowohl in der Proteinreinigung als auch im Zusammenhang mit radioaltiven Isotopen verwendet. Definieren Sie diesen Begriff für beide Verwendungsmöglichkeiten und geben Sie jeweils die eintsprechende Einheit an. Protreinigung: Maß für Reinheit U/mgRadioakt: Zerfallsrate/Masse GBq/mol
• Nennen Sie drei Methoden mit denen Sie die exxterne Invertase aus Hefezellen aufreinigen können. Welche Eigenschaft des Proteins nutzen die von Ihnen aufgezählten Methoden jeweils aus? Zeichnen Sie jeweils eine Strukturformel einer negativen und einer positiv geladenen Aminosäure und benennen Sie diese. Ammoniumsulfatfällung -> LöslichkeitIonenaustauschchromatographie -> LadungDialyse (SDS-Page) -> Größepos: Lysinneg Asparaginsäure (zeichnen nicht vergessen9
• Wie unterscheiden sich SDS-Page und Native PAGE in Bezug auf die Proteinauftrennung? Welche von beiden Methoden würden sie für ein Gel-Shift Assay (Methode zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure Wechselwirkungen) verenden? Begründen Sie Ihre Wahl SDS -> Trennung nach Größe (Molekulargewicht)SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS = Sodiumdodecylsulfat -> Detergenz-> Denaturiert Proteine -> alle Proteine haben das gleiche Verhältnis von Ladung/Masse = Ladungsdichte-> Eigenladung wird nicht beachtet/fällt weg und - Ladung hängt sich an die linarisierten Proteine-> Trennung nach Größe der Moleküle (weil Ladung proportional dazu ist)Native-Page -> Trennung nach Größe. Ladung und Konformation (Struktur/Faltung)-> nicht denaturiert -> noch funktionsfähig/AktivitätBei Gel-Shift-Assay würde man deswegen diese hier wählen, da man für die Untersuchung der Wechselwirkungen funktionsfähige Proteine braucht
• Eine Zelle in einem unterirdischen Speichergewebe hat über Transporter Saccharose aus dem Apoplasten aufgenommen. Formluieren Sie die Reationsgleichung (Nennung der Enzyme und Verbindungen. kein Stukturformeln) bis zur Stärkesynthese im Amyloplasten dieser Zelle- Machen Sie kenntlich, wleche Verbindung in den Amyloplasten importiert wird. siehe Bild Kl 2004 Fr 11Apoplast      Saccharose                            I                            VCytosol        Saccharose ----------> UDP- Glucose --------->Glucose 1-P--------------> Glucose 6-P                                     UDP->Fructose                PP->DTP                               Saccharose-Synthase    UDP-Glucose-Pyrophosphorylase  Phosphogluco-MutaseAmyloplast Gluc-6-P----> Glc 1-P--------------> ADP-Glucose --------------------------->Stärke                                                    ATP->PP(2P)                                                -> ADP                                            ADP-Glucose-Pyrophosphorylase     Stärke-Synthase
• Ist es ratsam in Gegenwart von hochenergetischer β-Strahlung eine Bleischürze zu tragen?Begründung Das radioaktive Element Radon ist ein natürlich vorkommendes α-Strahler. Weshalb ist eine Exposition mit Radon besonders schädlich? Formulieren Sie den Zerfall des Radons. Welches stabile Element steht am Ende der Zerfallsreihe? βℵαNein ist es nicht, weil es zu Brems- bzw Röntgenstrahlung führen würde Schädlich: wird zu β-StrahlungAm Ende ist BleiU-238----α----> Ra-226 -----α------> Rn-222 -------α-------> Po-218                                                                                               --α--> (pfeil nach unten)                          Po-214  <----- β-------Bi-214<----- β------- Pb-214                          --α--> (pfeil nach unten)                         Pb-206
• Sie verfüttern eine radioaktiv markierte Substanz an einzellige Grünalgen und messen zeitabhängig die Abnahme von Radioaktivität aus dem Kulturmedium. Sie erhalten folgenden Grafen (Kl 2004 Fr 13) oben kl Plateau, dann schnelle Abnahme, dann unten Plateau Erläutern Sie die einzenlnen Phasen des Kurvenverlaufs und erklären Sie ihr Zustandekommen Am Anfang noch keine Aufnahme der Grünalgen. Möglicherweise nicht kein induziertes Transportsystem. In dieser lag-Phase ist noch kein Transporter für Glc in der PM vorhanden. Induktion des Transporters. Muss noch transkribiert werden, translatiert, sekretorischer PathwaySinken der Radioakt im Medium ist uf Aufnahme der Substanz zurückzuführen.Keine weitere Radakt wird aufgenommen. Vllt kein Platz mehr für Trnsporter in PM oder Sättigung. Die Substanz kann scheinbar nicht verstoffwechselt werden, da ein Plateau entsteht (sonst würde die Kurve weiter leicht abflachen)
• Sie benötigen für einen Versuch 200 ml einer 25 mM NaCl-Lösung (MW NaCl: 58,44 g/mol). Für diese sollen Sie zuerst 500 ml einer 1 M Lösung herstellen und diese entsprechend verdünnen. Wie gehen Sie vor (genauer Rechenweg)? Stellen Sie zudem 400ml einer 20%igen Glukoselösung (MW Glucose: 180 g/mol) her. Wie viel Glukose müssen Sie einwiegen? Wie viel molar ist Ihre Lösung? a, NaCl:500 ml von 1M (1M=1mol/l) 1mol = 1mol/l;   0,5mol = 500ml n=m/M -> m=n*M = 0,5mol * 58,44 g/mol = 29,22g NaCl in 500ml -> 1M LsgVerdünnen:v1 * c1 = v2 *c2? * 1000mM = 200ml * 25mM -> v1 = 5mlalso 5ml der 1M Lsg und 195ml Wasser -> 200ml 25mM Lsgb, Glc400ml 20%400g = 100% ; ?g = 20% -> 0,2*400/1 = 80g Glukose einwiegenn = m/M = 80g/ 180g/mol = 0,44molc= n/V = 0,44mol / 0,4l = 1,1 mol/l = 1,1M
• Agrobakterien können ihre T-DNA ins pflanzliche Genom stabil integrieren. In der Pflanzenforschung wird diese Eigenschaft zur gezielten Transformation von Pflanzen verwendet, indem natürliche T-DNA gegen DNA-Konstrukte ausgetauscht wird, z.B. gegen Resistenzgene. Die Synthese welcher Substanzen wird durch die Genprodukte der Gene, die Agrobakterien natürlicherweise ins pflanzliche Genom übertragen, gesteuert? Welche Resistenzgene vermitteln die Resistenz gegen die Herbizide Glyphosat bzw. Phosphinotricin? Erklären Sie für beide Resistenzen jeweils das Wirkungsprinzip! Agrobakterien übertragen ihre T-DNA ins pflanzliche GenomT-DNA trägt Gene für- Tumor-Induktion (Aux und Cytok) (Synthese von Phytohormonen)- Synthese der Opine (ASderivate) und Nopaline -> nur von Bakt genutztPhosphinotricin (BASTA)Bar-Gene sind Resistenzgene, die Resistenzen gegen Gluphosinate (wie Phosphinotricin) vermitteln. Sie codieren für PAT (Phosphinotricin-Acetyltransferase), die Phorphinotricin acetylieren.Gluphosinat ist ein Glutamat-Analogon und hemmt die Glutaminsynthethase und führt zu einer Akkumulation von Ammonium in der PflanzeGlyphosat: Resistenzgene gegen Glyphosat beinhalten bakterielle EPSP-Synthase.Glyphosat ist ein PEP-Analogon, dass inden Shikimatweg eingreift und die EPSP-Synthase hemmt.
• Mit der PIG beschießen Sie Tabakblätter in getrennten Ansätzen mit folgenden DNA Konstrukten A : 35S-Promotor / Gen X / GFP B: 35S-Promotor / Gen Y / CFP Ihnen stehen Gold und Blei als Trägermaterial für die DNA zur Verfügung. Warum fällt ihre Wahl auf das Gold. Was versteht man unter der Todeszone des Beschusses und wie kann man diese erkennen? Warum spricht man von einer transienten Expression? Gold: wegen hoher Dichte und einem relativ kleinen Atomradium. Gold ist ein Halbmetall und nicht so giftig wie das Schwermetall Blei.Todeszone:PIG (Particle Inflow Gun). Die geschossenen Partikel verletzen die intakte Zellwand, sodass die in wässriger Phase mitgeschossene DNA bzw RNA über die Verwundungsstellen in die Zellen eindringen kann.Die Todeszone ist die Zone, in der die Zellen den Beschuss nicht überlebt haben/zu stark zerstört wurden. Erkennen kann man das über einen goldenen Schimmer, der durch die Goldpartikel zustande kommt (da wo sie aufgetroffen sind)Transient: Die Fremd-DNA wird nicht ins Wirtsgenom integriert und an Nachkommen weitergegeben. Sie wird nur für wenige Tage exprimiert, also vorübergehend
• Sie erhalten 100 µl einer wässrigen Lösung von λ-DNA. Sie wollen die DNA fällen. Dazu stehen 3 M Natriumacetet (pH 4,8) und 100 % Ethanol zur Verfügung. Welche Funktion erfüllen diese beiden Komponenten bei der Fällung? Wie führen Sie die Fällung durch? Nach den Fällen und Waschen resuspendieren Sie die DNA in 50 µl Wasser. Sie bestimmen die Absorption einer 1:100 Verdünnung dieser DNA-Lösung bei 260nm zu 0,1 Einheiten. Berechnen Sie die Masse der λ-DNA, die für weitere Experimente zur Verfügung steht ( 1 Einheit A260 = 50µg/ml). Aus der λ-DNA wollen Sie mit EcoRI und XhoI innerhalb einer Stunde ein 100 bp großes Fragment herausschneiden. Wie sieht der Restriktionsverdau aus, wenn Sie 10 µg dieser DNA in einem 50 µl-Ansatz schneiden wollen? Setzen Sie die definierte Mindestmenge beider Enzyme ein. Neben der DNA-Lösung stehen folgende Bestandteile zur Verfügung: 10x Puffer Wasser 35S-Promotor Gen X GFP 35S-Promotor Gen Y CFP EcoRI in Glycerin (5U/µl) XhoI in Glycerin (10 U/µl) a, Funktion Natriumactetat: sorgt für niedrigen pH-Wert -> DNA in protoniertem oder ungeladenem zustand -> verringert die Löslichkeit von DnA (teilweise protoniert-> hydrathülle verdränt-> da ungeladen)Funktion Ethanol: sorgt für weniger polare (alkalische) Umgebung und verringert damit die Löslichkeit von DNA (-> Hydrathülle weg)Durchführung:1. Na Acetat (1:10) und Ethanol (3 fach) zu den Verdaus pipettieren. 15min in den Froster2. DNA in Tischzentrifug pelletieren3. Überstand abziehen, DNA-Pellet mit 70% Eth waschen, Ethanol abziehen4. Cups zum schnellen Trocknen in Speed Vacs5. Pellet in sterilem Wasser lösenb, 100μl DNA wird mit NaAcetat& Eth gefällt. DNA in 50μl Wasser aufgenommen. wird 1:100 verdünnt und bei 260nm vermessen  50μl 1:100 -> 0,05μl aus Verdünnung gemessen  DNA: 1 OD E260 = 50μg/ml             0,1 OD = 5μg/ml -> 1:100             -> 500μg/mlm=c*V= 500μg/ml * 0,5μl = 25μg-> 25μg DNAc, Berechnung wie andere AufgabeDNA: 20μl (DNA: 25μg/50μl-> 50μg/100μl-> 0,5μg/μl)EcoRI: 2μlXhoI: 1μlPuffer: 5μlWasser: 22μl
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• Sie sollen von einem Southern Blot nach der Hybridisierung unspezifisch gebundene Sonden-DNA entfernen. Ihnen stehen folgende Lösungen und Materialien zur Verfügung: 2x SSC 1% SDS Hybridisierungsofen mit Thermostat Millipore Wasser Sie möchten drei Waschschritte vornehmen und dabei bei jedem Schritt die Stringenz des Waschens erhöhen. Durch welche Parameter können Sie die Stringenz erhöhen? Formulieren Sie ein mögliches Protokoll für das Waschen in drei Schritten unter Berücksichtigung dieser Parameter! Erhöhung der Stringenz durch erhöhte Temperatur und reduzierte SalzkonzentrationNach der Hybridisierung sollen unspezifisch gebundenen DNA-Sonden vom Southernblot entfernt werden. mögliches Protokoll:1. Sonde abpipettieren2. blot bei Raumtemp im Schüttler waschen (2x  Waschlsg)3. Blot 2x für 15min bei 68°C Schütteln (0,1x Waschlsg)(Durch Verdünnen versch Salz & Detergenz Waschlsg -> weniger Salz -> merh Temp)2x SSC Raumtemp1x SSC Raumtemp0,1x SSC 68°C-> salz runter, temp hoch
• Sie möchten die Expression des β-Glukuronidasegens unter Kontrolle eines leitbündelspezifischen Promotors in transgenen Tabakpflanzen überprüfen. Nennen Sie zwei Methoden, die Aktivität des Genprodukts nachzuweisen und nennen Sie Vor- und Nachteile beider Methoden X-Gluc Test: inkubation der Pflanzen in GUD-Staining-Solution und X-Gluc Lösung -> β-Glukuronidase soll das Substrat x- Gluc spalten udn als produkt einen blauen Fabstoff freisetzen.Eignet sich für Lokalisation(wo wird das Gen exprimiet) aber nich quantifizierbarMUG-Test: Pflanzen zerkleinert und mit MUg-Substrat versetzt. Bei β-Glukuronidase-Aktivität entsteht ein fluoreszierender Farbstoff, der über UV-Licht ssichtbar gemacht wirdKeine Lokalisation aber dafür Quantifizierbar
• Sie messen im Kurs die Aktivität der externen Invertase an lebenden Hefezellen. Formulieren Sie kurz die Reaktion des verwendeten Nachweistests. Erklären Sie, warum Sie die Zellen vor dem Invertase-Aktivitätstest mit Natrium-Azid waschen. Wie könnten Sie die Hefezellen gentechnisch modifizieren, um den gleichen Effekt zu erzielen? Hexokinase-TestSaccharose ---> Fructose + GlucoseGlucose + ATP <------- G-6-P + ADP (Hexokinase/Mg2+)G-6-P + NADP+ <------ Gluconod(?) -6-P + NADPH (G-6-P-DH 340nm)Die Menge des gebildeten NADPH ist proportional zur Glucosemenge; gekoppelter, optischer TestWaschen mit NaAzid: Stoppen des Stoffwechsels und die Zellen sterben ab. Die Enzyme bleiben aber Intakt, sodass ihre Aktivität durch 15min inkubation mti Saccharose später nachgewiesen werden kannz.B Glykolyse (Hexokinase) hemmen (?)
• Zeichnen Sie die Strukturformel des Disaccharids Zellobiose. Welches Substrat verwendet die Zellulosesynthase zum Aufbau der Zellulosekette? Formulieren Sie die Reaktion, bei der dieses Ausgangsprodukt in der Pflanze vornehmlich gebildet wird Cellobiose. Dsaccharod aus zwei Glucosemoleküle, Verknüpft durch β1,4-glykosid. BidnungUDP Glucose Saccharose--------------> UDP-Glucose ----------------> Cellulose                        -> Fructose                  Saccharose Synthase         Cellulose Synthase
• Bei einem Experiment vermuten Sie den Einfluss eines chemischen Quenchers. Wie wirkt ein chemischer Quencher Sie führen zur Kontrolle eine Interne Standardisierung durch und erhalten folgende Werte: Messung der Probe 4500cpm Messung nach Zugabe von 1400dpm des internen Standards: 5550cpm Wie viel Radioaktivität in Bequerel befindet sich in Ihrer Probe? chemischer Quencher: verdünnt Szintillator PPP und Toluou-Moleküle-> Wahrscheinlichkeit für zusammentreggen von PPO und Toluol sinkt-> Energieübertragung von Isotop auf Toluol und von Toluol auf PPO wird beeinträchtigt-> je höher die Konz des Quenchers, desto höher die LöschwirkungProbe      4500mit 1400  5550Differenz: 1050Erhöhunh der Zählrate von 4500 auf 5550 ist auf Zugabe von 1400dpm zurückzuführen. Zählausbeute:Δcpm / bekannte dpm *100 = 1050/1400 *100 =75%1 Bq -> 1 Zerfall pro secdpm= decays (Zerfälle) per minute (Zerfallsrate; absolutes Maß)cpm= counts per minute (Zählrate; durch Zählverfahren erfasste Zerfälle, relatives Maß)4500cpm sind 75% der eigentlichen Radioaktivität in dpm4500 = 75% ; ? =100% --> 6000dpm6000 Zerfälle in 1min -> 60sec100 in 1 sec--> 6000dpm = 100 Bq
• Erklären Sie kurz das Prinzip der Ammoniumsulfatfällung von Proteinen. Bei einer Proteinreinigung geben Sie zu Ihrer Probe Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 25 % (100 % Sättigung = 4 M). Die nach Zentrifugation erhaltenen 10 ml Überstand dialysieren Sie zweimal gegen jeweils 990 ml Puffer bis zum Konzentrationsausgleich. Wie ist die Ammoniumsulfatkonzentration des Dialysats am Ende der Diylyse? Welches Puffervolumen müssten Sie einsetzen, um die gleiche Endkonzentration in einem Schritt zu erreichen? Nennen Sie zwei weitere Faktoren, durch deren Verlängerung die Löslichkeit von Proteinen ebenfalls beeinflusst werden kann Prinzip: stark geladene Ammonium-ionen (NH4+) und Sulfat-Ionen (SO42-) hydratisieren-> entziehen den Proteinen die Hydrathülle-> Aggregatbildung der Proteine durch hydrophobe WechselwirkungenFraktionierte Fällung:Verschiedene Prtoeine fällen bei unterschiedlichen (NH4)2SO4- Konzentrationen;bei glycosylierten Proteinen hoch, da Zuckerseitenketten guten Kontakt zu Wassermolekülen herstellen-> schlecht lösliche Proteine fallen aus (interne Invertase)-> glykosylierte Proteine gut löslich, daher im Überstand (externe Invertase)25%=1M10ml -> 0,01M --10ml---> 1:100=1*10^-4M ---10ml----> 1:100 =1*10-6M                                                    1. Dia                                     2.Diaalso 1*10^-6mol in 10mlWenn nur 1x -> insg verdünnung 1:1000000 -> 1 und 999999 bei 10ml -> 999990ml PufferVeränderung Löslichkeit:pH (nahe pI)organische LMtemperaturPEg( Polymerisierter Zuckeralkohol - stark polar)
• In welchen Formen gelangt der im Chloroplasten fixierte Kohlenstoff ins Cytoplasma? Beschreiben Sie kurz den apoplastischen und den symplastischen Weg der Phloembeladung. Welches Kohlenhydrat stellt die Haupttransportform bei Pflanzen mit apoplastischer Beladung dar? Formulieren Sie unter Nennung der entsprechenden Enzyme die Synthesereaktion dieses Kohlenhydrats. Welcher andere Zucker wird bei symplastischen Beladern in deren Phloem noch hauptsächlich transportiert? Welche Monomere sind dort wie miteinander verknüpft? Troisephosphate; Glycerinaldehyd-3-Phosphat; Dihydroxyacetonphosphat (2 ce Körper)-> Assimilationsstärke und dann im Cytosol Bildung von SaccharoseSymplastisch: im Cytoplasma der durch Plasmodesmata verbundenen Zellen. Durch Plasmaströmung und andere Transportmech (unbkannt)Apoplastisch: Diffusion der Assimilate in dem freien Diffraum in den Zellwänden nach aktiver Übergabe durch das Plasmalemma-> von den photosynthetisch aktiven Mesophyllzellen werden die Assimilate symplastisch über die Bündelscheide in parenchymatische Zellen im Leitbübdel verfrachtet.Die Beladung des Phloems selbst erfolgt dagegen über apoplastischen Transport.Saccharose:UDP-Glucose + Fructose -6- Phosphat ---Saccharose-Phosphat-Synthase(SPS)-->--> Saccharose-6-Phosphat------Sacharose-Phosphat-Phosphatase---P weg--->---> SaccharoseSymplastisch: auch Raffinose und Stachyose Verknüpfte Galactose bzw Fructosemonomere
• Phloembeladung Symport Antiport -Fluss von Assimilaten, v.a. Saccharose, aus den Zellen des Mesophylls in die Siebelemente der Leitbündel- erfolgt i.d.R im photosynthetische aktivem Source-Gewebe- Aufnahme in den Siebelement-Geleitzellen-Komplex- apoplastisch oder symplastisch möglichSymport: gleichgerichteter Transport verschiedener Substanzen über ein gemeinsames TransportproteinAntiport: entgegengerichteter Transport verschiedener Substanzen über ein gemeinsames Transportprotein
• In einem Aufnahmeexperiment werden Chlorella kessleri-Zellen mit radioaktiv markierter Glukose gefüttert. Dazu werden zu 1 ml Algensuspension 10 µl einer 100 mM Glukoselösung gegeben. Zum Zeitpunkt 10 min werden 100 µl abfiltriert und der Filter in ein Szintgläschen gegeben und zudem werden weitere 100 µl direkt in ein Szintgläschen pipettiert. Es werden gezählt: 8500 cpm im Gläschen mit dem Filter 34000 cpm im Gläschen mit 100µl der gesamten Algensuspension Wie viel nmol Glukose wurden nach 10 min von den Algen aufgenommen? 1ml Algen + 10 μl (100mM) Glc -> 100mmol/l=100mmol/100ml=0,1mmol/ml=0,1mol/l8500/34000 = 0,25 =1/4 von 10μl einer 100mM Gluclsg (0,1mol/l)c=n/V (die 10^-6 wegen der 100μl in Szintgläs)n=c*V = 0,1mol/l * 0,25 * 10^-6 L = 0,25 * 10^-7 mol = 25 *10^-9 mol = 25 *10^3 μmol = 25nmol
• Nennen Sie drei Mechanismen zur posttranslationalen Modifizierung von Proteinen Phosphorylierung: Kinasen/Phosphatasen; Regulation v Signalkaskaden (reversibel) Acetylierung: Regulation (Histonen an der ε-Aminogruppe) Hydroxylierung: Stabilitär von Strukturproteinen Glycosylierung: Sekretion (siehe N-Gylkosylierung)Lipid-Anheftung: Membranassoziation Prozessierung: reife Proteine; proteolytische Abspaltung, prosthetische Gruppen nicht kovalente Metall-Ionen: Ca2+ second messenger; Mg2+ ATP-Enzyme, Cu2+, Ni+, Fe2+
• N-Gylkosylierung der Invertase Glykosylierung der Aminogruppen in den Seitenketten Asn-X-Ser, Asn-X-Thr (X wie Prolin)13 Sequons in Invertase -> 7 immer -> 5 unterschiedlichSynthese der Zuckerseitenketten nicht direkt an wachsender Polypeptidkette, sondern an "Doilicholphosphat" = Lipidphosphat der ER-Membran; = Isoprenoid-> dort wird Struktur aus 14 Zuckerresten gebildet:gemeinsam Co-translational auf wachsende Polypeptidkette -> 2 N-Acetylglukosamine; 9 Mannosen; 3 Glucosen(später 3 Glucosen und 1 Mannose weg)
• Nennen Sie drei Verfahren, mit denen Sie die Expression oder das Produkt eines Gens auf zellulärer Ebene nachweisen können. Was weisen Sie mit den Verfahren jeweils nach? - GUS/X-Gluc -> Lokalisation- MUG -> Quantität- GFP-Markierung -> Lokalisation- AK-Markierung- immunologischer Nachweis -> Lokalisation (siehe PmSUC2- Markierung)- Northern Blo bzw. RT-PCR -> Sequenz, Gen, etcGen isolieren; Promotor isol. und amplifizieren; Reportergen hinter Promotor klonieren-> in E.coli-> vermehren
• Beschreiben Sie knapp die prinzipielle Vorgehensweise, um die intrazelluläre Lokalisation eines Proteins an der lebenden Zelle zu untersuchen -AK-Behandlung, Fluoreszenzmarkierung, Laser-Scanning Mikroskop. (wie bei PmSUC2 mit Cy2- Mit Reportergen GFP fusionierte Proteine (?)
• PIG Warum liegt das Pflanzenmaterial auf hypertonischem Medium? Welche Eigenschaften müssen ballisitische Materialien ( die Munition) zum Beschießen aufweisen? Welches Material wird deshalb zweckmäßig verwendet? hypertonisch: weil merh Ionen-> entzieht Pflanzen Wasser-> Sog von Wasser nach unten; zieht DNA oben nachMaterial: klein, hohe Dichte, nicht toxisch -> Gold oder Wolfram
• - nennen Sie drei Proteineigenschaften, über die sich Proteine trennen lassen und geben sie die entsprechenden Trennverfahren an - Nennen sie drei Faktoren, die während einer Proteinreinigung die Stabilität von Proteinen beeinflussen Mit welchen Maßnahem haben sie dies im Praktikumsversuch bei der Anreicherung der Invertase berücksichtigt? - Löslichkeit: Ammoniumsulfatfällung; Ladung: Ionenaustauschchronatographie; Größe: SDS-Page (Dialyse); Affinität: Sepharose, Affinitätschromatographoe- pH (Puffer); Temperatur (kühlen, auf Eis); Proteasen (Proteaseinhibitoren PMSF)Oxidation (β-Mercaptoethanol= Reduktionsmittel)
• Mit der PAS-Silberfärbung können Proteine detektiert werden. - Welche Eigenschaften müssen Proteine aufweisen, um mit dieser Methode gefärbt zu werden? - Welche Reaktion bewirkt die Perjodsäure und warum ist dieser Schritt essentiell für die Färbereaktion? - glykosylierte Proteine-Reduktionen der Silber-Ionen zu elementarem Silber1. Perjosäure hydrosyliert Kohlenhydrate zu Aldehydgruppen (spaltet den Zucker), essentiell um reaktive reduzierte Aldehydgruppe herauszubekommen2. Nachweis von Aldehydgruppen mit Hilfe von Silbernitrat
• Sie führen einen Western-Blot durch. Dazu benötigen Sie 500ml Blockierungspuffer, der folgendermaßen zusammengesetzt ist: 20 mM NaH2PO4 100mM Na2HPO4 100mM NaCl 0,1% Tween 20 (v/v) 1% BSA Es steht folgendes bereit: 1l 1M NaH2PO4 Lösung 1l 1M NaH2PO4-Lösung 1 kg NaCl (MW=58,4 g/mol) 100 ml 50% Tween 20-Lösung 1 kg BSA (w/v) a, Wozu dienen die einzelnen Pufferkomponenten b, wie viel müssen Sie von den einzelnen Substanzen jeweils einsetzen (Rechenweg!) a, NaH2PO4 -> Puffer für richtigen pH für den AK: basisch wie im BlutNaCl -> für Ionengleichheit: soll den Salzgehalt dem Blut anpassen (isotonisch)Tween 20 -> Detergenz; nicht ionisch wie SDS; bindet Fett (Micellenbindung)-> oberflächenspannung v H2O wir gebrochen; denaturierende WirkungBSA -> deckt alle freien Bindestellen ab -> Ak kann nicht binden -> nur spezifische Bindung -> Hintergrund kann vermieden werden-> simmuliert Blutb, 500 ml Blockingpuffer:NaH2PO4 soll 20mM-> c1*v1=c2*v2 -> 1000mM * v1 = 20mM * 500ml -> v1 = 10mlNaH2PO4 soll 100mM-> c1*v1=c2*v2 -> 1000mM * v1 = 100mM * 500ml -> v1 = 50mlNaCl soll 100mM-> 100mmo/l NaCl = 0,1mol/l -> 0,05mol = 50mmol pro 500mlc=n/V -> n=c*V = 0,1mol/l*500ml = 0,05mol=50mmoln=m/M -> m=n*M= 0,05mol * 58,44 g/mol = 2,92gTween 20 soll 0,1%-> c1*v1=c2*v2 -> 50%*v1 = 0,1% * 500ml -> v1= 1mlBSA soll 1%-> 1% (w/v) von 500ml = 5g
• Sie möchten mit einem einzelligen Organismus ein Experiment durchführen. Dazu bekommen Sie 400ml Kultur mit einer OD von 1,5. Für das Experiment müssen die Zellen nun auf OD 20 eigestellt werden. a, In wie viel Puffer müssen sie das abzentrifugierte Pellet dafür aufnehmen (Rechenweg)? Nun führen Sie mit den Zellen Aufnahmetests mit einem 14C-markiertem Zucker solange durch, bis sie keine weiter Zunahme der Radioaktivität in den Zellen messen. Sie erhalten zum letzten Messzeitpunkt folgende Messergebnisse: 120cpm in 100μl abfiltrierten Zellen 6000cpm in 100μl Gesamtprobe (Zellen+Überstand) Da Ihnen die Radioaktivität der Gesamtprobe zu niedrig vorkommt, geben sie 14C-Präparat mt 4000dpm dazu und messen die Gesamtprobe noch einmal. Das Ergebnis der Messung ergibt nunr 9000cpm. b, wie heißt das von Ihnen angewendete Verfahren? c, Berechnen Sie die prozentuale Zählausbeute ihrer Gesamtprobe d, Wie hoch ist die tatsächliche Zerfallsrate Ihrer Gesamtprobe und Ihrer gemessenen Zellen? Um die Anreicherung der Radioaktivität in Ihren Zellen bestimmen zu können, eritteln Sie mit 500μl Ihrer Zellen das Zellvolumen und erhalten (nach Abzub von 30% Zwischenzellwasser) ein Volumen von 10μl "packed cells" e, Berechnen Sie die Anreicherung der Radioaktivität in Ihren Zellen f, welcher Schluss lässt sich anhand dieses Ergebnisses auf die Art der von Ihnen gemessenen Aufnahme ziehen? a, 400ml mit OD 1,5 ; xml mit OD 20 -> 20/1,5=13 -> 400/13 = 30ml Pufferb, interne Standardisierungc, 6000cpm ohne Präp    9000cpm mit Präp    3000cpm Differenz    Δcpm/bekannte dpm *100 = 3000cpm/4000dpm *100 = 75%d, 6000cpm = 75%; X dpm = 100 % -> 8000dpm (gesamt)    (Zellen: 120cpm =75% -> 100% = 160dpm)e,  500μl Zellen -> Volumen 10μl packed cells    Volumenfaktor: Probevolumen/Zellvolumen = 500μl/10μl = 50     8000dpm Gesamt       160dpm in der Zelle    7840dpm außerhalb    Redioatkivitätsfaktor: außerhalb/Zellen = 7840/160 = 49    -> Anreicherungsfaktor: Volfaktor/Radakfaktor = 50/49 = 1,02f, sehr niedrig
• Sie wollen untersuchen, zu welchen Produkten Chlorellen Glucose verstoffwechseln. Dazu inkubieren Sie Chlorellen über Nacht mit 14C-markierter Glucose. Danach führen Sie mit dem Zellextrakt eine Dünnschichtchromatographie durch (hydrophile stationäre Phase, lipophile mobile Phase). Die Produkte detektieren Sie autoradiographisch. Um die Produkte zu Identifizieren, tragen Sie auf die DC Plasst folgende radioaktive Standards auf: - Glucose - Glucose-6-Phosphat - 3- O- Methylglucose - Saccharose Das Autoradiogramm sieht folgendermaßen aus ( Kl 2002 Fr 10) bei A punkt weit unten, bei B etwas höher, bei C noch etwas höher, bei D noch höher Probe hat unten eine dann eine Fette auf höhe punkt A, dann eine kleine etwas unter punkt D und eine kleine etwas über Punkt D. Ganz oben ist so ein fetter Schmier Standard A ist Saccharose a, Ordnen Sie die anderen Standards zu un begründen Sie Ihre Antwort b, Waarum können Sie keinen der drei Standards B,C und D im Zellextrakt erkennen (kurze Begründung für jeden Standard) c, Zeichnen Sie die Strukturformel von β-3-O-Methylglucose A Saccharose: hydrophil, bleibt bei hydrohiler stationärer PhaseB G-6-P: - geladen, meist hydrophilC Glukose: ist hydrophober, wandert weiterD: 3-OMG: Methyl (CH3) mach es hydrophober -> organisch -> und 1 Hydroxylgruppe wenigerA Saccharose wird aus 14C-Glc gebildet und kann detektiert werdenB nicht, weil Glc-6-P weiter verstoffwechselt wirdC nicht, weil Glukose auch weiter verstoffwechselt wirdD nicht, weil es nicht in der Probe ist, da wir nur mit 14C-Glc inkubiert haben (wird nicht gebildet)β-3-O-Methylglucosesiehe Fragenkatalog

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