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Labormedizin (Fach) / PCR (Lektion)

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• Wie ist die Methodik der PCR im Allgemeinen? Polymerase Kettenraktion: 1. Denaturierung der DNA bei 92°C in zwei Einzelstränge 2. Annealing der Primer bei 50°C 3. Extension der Primer durch DNA-Polymerase bei 70°C (beginnend beim 3'-Ende des Primers) Bei RNA-Viren erfolgt vorab eine reverse Transkriptase.
• Was ist eine PCR? Bitte beschreiben Sie kurz die Real-Time PCR. Eine Nukleinsäure Amplifizierende Technik (Vervielfältigung von DNA oder RNA). Polymerase-Kettenreaktion: Produkte von den vorherigen Zyklen bilden den Ausgangsstoff für den nächsten Zyklus und es kommt zur exponentiellen Vermehrung. Real-Time-PCR: Nukleinsäureamplifikation und Deketion in einem. Quantifizierung ist durch Standardkurven möglich. Möglichkeiten der Real-Time sichtbarmachne der Amplifikation: Einlagerung eines Fluoreszenzfarbstoffes in den DNA Doppelstrang. Farbstoff der durch einen Quencher geblockt ist und erst wenn er bei der Amplifikation entfernt wird die Fluoreszenz aktiviert wird. Fuoreszenzfarbstoff der Fluoresznz-Rsonanzenergietransfer (FRET) ausnutzt. Donor-Fluorchrom wird durch eine Lichtquelle angeregt und gibt Energie an ein Akzeptor Fluochrom (Quencher) ab. Das Signal ist hoch, wenn der Abstand zwischen Donor und Akzeptor gering ist!
• Was ist bei der PCR im Allgemeinen zu beachten? Wie kann man bei der PCR Kontaminationen vermeiden? Trennung zwischen DNA-Isolierung, PCR-Ansatz, PCR-Amplifikation, Analyse. Präanalytik = Nukleinsäureextraktion Postanalytik = Amplifikation, Detektion Primerlänge 20bp Kontaminationen vermeiden durch Uracileinbau
• Wie detektiert man Mutationen nach der PCR? Restriktionsenzyme, Sequenzierung, Schmelzpunktanalyse
• Wie kann man feststellen ob überhaupt ein PCR Produkt entstanden ist, wenn man einen Test neu aufbaut? Gelelektrophorese mit einer klaren Bande.
• Wann werden PCR-Methoden angewendet? Erregernachweis, Mutationsanalyse
• Was sind die Vor- und Nachteile der PCR? Vorteil: Sehr sensitive Methode Nachteil: Laborabhängig, Auswahl der Primer, Kreuzreaktionen mit menschlicher DNA.
• Wo hat die PCR bei der TBC ihre Berechtigung? Vor Allem bei atypischen Mykobakteriosen. Schnelle Identifiktaiton von M.tuberkulosis und Resistenzgenen (Rifampicin). Bei dringendem Verdacht auf Tuberkulose und die Kultur nicht abgewartet werden soll (Liquor) Allgemein bei schwer anzüchtbaren Erregern, 16s-RNA-PCR, Vervielfältigung der 16s-RNA mit Primern für die konservierten Regionen.
• Ist die HCV-PCR bei länger zurückliegenden negativen HCV-AK vor einer Knochenmarksspende sinnvoll? Ja. Inkubationszeit der HCV bis zu 26 Wochen. Die PCR ist bereits nach 10-14 Tagen aussagekräftig
• Was ist eine Sonde? Eine Sonde ist eine kurze Einzelstrang DNA, die sich an die passende DNA-Sequenz im Gen anlagert (Gensonde). Direkter Nachweis über radioaktiv oder fluoreszenz markierte Sonden. Indirekter Nachweis über Biotin oder Streptavidin.
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• Was ist eine Hybridisierung? Anlagerung eines Nukleinsäurestrangs an einen komplementären DNA oder RNA Strang.
• Welche molekularbiologischen Methoden gibt es? Welche Methoden gibt es zur Amplifikation von Nukleinsäuren? Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Heute fast immer als Real-Time-PCR mit Detektion des Amplifikates in Echtzeit. Dabei ist auch eine Quantifizierung möglich. Transcription Mediates Amplification (TMA): Isothermes Verfahren, das als Target die RNA und DNA erkennt. Random-Access-Systeme (Vollautomaten): Vereint Nukleinsäureextraktion, Amplikfikation, Detektion.
• Unterschiede zwischen PCR, Ligase-Kettenreaktion (LCR) und Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NSABA)? Wofür eignen sich die Methoden? Ligase Kettenreaktion (LCR): Temperaturunabhängig, Ligase anstatt der Polymerase. Als Primer werden vier komplementäre Nukleotide verwendet deren Sequenz genau nebeneinander auf der Ziel-DNA liegen. -> Weniger Fehler als bei der PCR (Taq-Polymerase), dadurch können mehr Zyklen durchgeführt werden. Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NSABA): Isotherme Reaktion. 3 verschiedene Enzyme (reverse Transkriptase, RNase-H, T7-RNA-Polymerase). -> RNA Amplifikation, vor Allem für Viren sinnvoll. Methode ist schnell, aber relativ Komplex und teuer.
• Was weist ein Southernblot nach? Northernblot? Westernblot? DNA. RNA. Proteine.
• Beschreiben Sie den Ablauf einer anderen Amplifikationsmethode außer der PCR. Isotherme Verfahren wie die NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) oder die TMA. Oder die Temperaturabhängige LCR (Ligase Kettenreaktion) als sehr genaues Verfahren. LCR: Temperaturabhänig. Ligase anstatt der Taq-Polymerase. 4 Primer. Kurze Zykluszeit. NASBA: Isotherme Reaktion. 3 Enzyme: Reverse Transkritase, RNase-H, T7-RNA Polymerase. Aufwendige Methode zur Amplifikation von Virus RNA.
• Warum ist RNA instabilder in der Umgebung als DNA? RNasen an unseren Händen auf der Haut (Teil der angeborenen Immunantwort). RNA wird schnell abgebaut.

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