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Molekulare Tierzucht (Fach) / Transgene Tiere (Lektion)

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• Züchtung <-> Gentechnik Erstellung von Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren mit neuen / verbesserten Eigenschaften Züchtung: indirektes Einbringen durch Kreuzung neben erwünschten auch unerwünschte Eigenschaften Elimination über Rückkreuzung Gentechnik: direktes Einbringen einer speziellen genetischen Information
• Gentechnisch Veränderte Organismen (GVO) bei denen das genetische Material (DNA) in einer Weise verändert wurde, die in der Natur durch Kreuzung oder natürliche Rekombination nicht vorkommt
• Gentransfer = Übertragung von in vitro erzeugter DNA (=Gen- /DNA- Konstrukt, Transgen) in Körper- oder Keimbahnzellen Empfänger tragen Transgen: nur in einigen Zellen oder in Zellen einzelner Organe oder in allen Zellen (Ziel für Erzeugung transgener Tiere) Möglichst in Keimbahnzellen (Keimbahn-Gentransfer) -> Weitergabe an Nachkommen möglich -> Erzeugung transgener Nachkommen /Linien
• Transgene Zellen / Idnividuen tragen neue DNA in erblicher Form -> Transgen wird mit den Chromosomen auf alle Tochterzellen weitergegeben i.d.R. ist Expression des Transgens das Ziel Durch den Gentransfer sollen Eigenschaften des Empfängers beeinflusst werden oder neu entstehen
• Strategien beim Gentransfer in Keimbahnzellen = Art der damit ausgelösten genetischen Veränderung in den Zielzellen Insertion = Genaddition des Transgens an zufälligen, meist mehreren Stellen des Genoms oder Zielgerichtete Integration = Gene Targeting des Transgens an einem ausgewählten Locus
• Insertion Genaddition i.d.R. mehrere Insertionen pro Experiment Orte der Integration der eingefügten Kopien ist meist zufällig (nicht-homolog) Das addierte Gen wird dann zusätzlich exprimiert (Überexpression) oder inhibiert Genexpression (-> Genprodukt des addierten Gens verhindert Fkt. des endogenen Genprodukts = Gene Trapping oder Antisense-Gene)
• zielgerichtete Integration zielgerichtete Änderung einzelner DNA-Abschnitte des Genoms = Gene Targeting Finden des gewünschten Gens und dann homologe Rekombinationen -> das Transgen geht an die Stelle der endogenen DNA-Sequenz und ersetzt diese Zur gezielten Inaktivierung von Genen (Knockout-Mutation) oder zur Einführung einer neuen Genfunktion (Knockin-Mutation)
• Gene Targeting und homologe Rekombination DNA-Konstrukt enthält: Zwei zum Ziel-/Target-Gen homologe DNA-Sequenzabschnitte -> Anreicherung /Selektion von Zellklonen, die die seltene homologe Rekombination tragen mit Hilfe von Selektionsmarkergenen
• Expression von Transgenen ubiquitär: in allen Geweben verbreitete Expression des Transgens; zum Beispiel durch humanen Ubiquitin-C-Promotor gewebsspezifisch: durch Response-Elemente; binden gewebsspezifische Transkriptionsfaktoren; begrenzen die Genaktivität auf bestimmte Gewebe regulierbar: durch regulatorische DNA-Abschnitte, die sich durch exogene Substanzen induzieren lassen -> experimentelle Steuerung der Transgen Expression
• Gentransfer-Verfahren Mikroinjektion = in Vorkerne befruchteter Eizellen Kertransfer = Transfer von Zellkernen aus transgenen somatischen Zellen in entkernte Eizellen mit Hilfe embryonaler Stammzellen durch Infektion von Embryonen mit rekombinanten Viren Mit Hilfe von Spermien
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• Mikroinjektion direkte Injektion der DNA in den Zellkern Entnahme von befruchteten Eizellen aus weiblichem Tier Injektion der DNA (1-2 picoliter) in einen der beiden Vorkerne (meist in männl.) -> i.d.R. gelangt DNA später in alle Zellen Sofortige Übertragung der Zygote in zyklussynchronisiertes Leihmutter-Tier oder Kultivierung bis Blastocyten-Stadium und anschl. Übertragung
• Mikroinjektion Vor- und Nachteile Vorteile: Routineverfahren häufig erfolgreich, auch bei Erzeugung transgener Tiere Nachteile: geringe Effizienz hoher techn. Aufwand nur Genaddition möglich -> variable Insertionsstelle und Zahl der Kopien häufig Mosaike (Transgen nicht in allen Zellen)
• Kerntransfer Transgene Körperzellen (bzw. deren Kerne) werden in zuvor entkernte Eizellen überführt Kultivierung somatischer Zellen Transfektion mit dem DNA-Konstrukt Selektion solcher Zellen, die das Transgen integriert haben -> Nutzung für Kerntransfer Injizieren einer solchen Zelle in eine entkernte Eizelle Kultivierung und ET in ein Empfängertier
• Kerntransfer Vor- und Nachteile Vorteile: Gene-Targeting möglich alle Zellen des Nachkommen enthalten das Transgen bei vielen Spezies möglich relativ hohe Effizienz (besser als Mirkoinjektion) Nachteil: hoher technischer Aufwand
• Gebräuchliche Verfahren zur Transfektion von Zellen für den Kerntransfer Transfektion = Einbringen von Fremd-DNA/RNA in Zellen Physikalische Verfahren: Mikroinjektion Elektroporation Chemische Verfahren: Kalzium-Phosphat-Transfektion; Lipofektion Biologische Verfahren: Einsatz retroviraler Vektoren
• Elektroporation Zellmembranen werden durch Anwendung von Strom durchlässig für DNA-Moleküle gemacht (Öffnung von Poren) häufig bei Gentransfer in embryonale Stammzellen einfach, aber nur wenige Zellen enthalten das Transgen
• Kalzium-Phosphat-Transfektion Kalzium-Phosphat wird natürlicherweise von Zellen durch Phagozytose aufgenommen geeinet für phagozytotisch aktive Zellen Bindung von DNA an Kalzium-Phosphat-Präzipitat -> Zugabe zu Zielzellen -> Phagozytose des Genkonstrukts, DNA gelangt zum Teil bis in den Zellkern, Einbau der DNA in das Genom
• Lipofektion DNA bindet an positiv oder negativ geladene Liposomen Endocytose oder Verschmelzen mit Zellmembran DNA gelangt in das Zellinnere, wird aber nur teilweise in das Genom eingebaut Methode wird z.B. auch verwendet, um Spermienzellen zu transfizieren -> Gentransfer mit Spermien
• Einsatz retroviraler Faktoren Retroviren: haben RNA als Genom (und replizieren über DNA-Zwischenstfue) DNA-Form ihres Genoms kann in Wirts-Genom integriert werden (integrierte Virus-DNA = Provirus) Gentransfer: Ersatz der meisten Provirus-Gene in vitro durch Fremd-DNA -> Umschreiben in RNA -> Verpacken in infektiöse Virushülle Kultivierung mit befruchteten Eizellen oder Embryonen -> Transfektion der Virus-RNA
• Nachweis der Transgenität wieso und wie? häufig geringe Erfolgsraten des Gentransfers, durch geringe Effizienz der Verfahren -> hoher Zeit- und Kostenaufwand Einbau des Transgens evtl. nicht homolog, unvollständig, mit Chromosomen-Mutaion etc. -> Nachweis nötig, ob Gentransfer OK oder nicht Nachweis von: Vorkommen des Transgens in den Zellen und Integration in das Genom Vererbung auf Nachkommen Expression des Transgens
• Nachweis des Transgens in den Zellen Southern-Blot-Hybridisierung Restriktionsspaltung der chromosomalen DNA Elektrophorese der Fragmente Transgen-spezifische DNA-Sonden (komplementär zu Transgen-spezifischer Teilsequenz) Nachweis von Banden, in denen sich das Transgen befindet
• Nachweis der Integration des Transgens in das Genom PCR Erzeugung eines transgen-spezifischen Amplifikats auch Nachweis eines erfolgreichen Gene-Targetings (d.h. Einbau des Transgens an gewünschter Stelle) möglich DNA-Sequenzierung und Vergleich der flankierenden Abschnitte mit Datenbanken -> Identifizierung der Position, die das Transgen im Genom eingenommen hat Reportgene Co-Transfektion eines Reportergens (zusammen mit dem Transgen) und Nachweis der Expression dieses Reportergens Nachweis von Chimärismus
• Nachweis der Vererbung eines Transgens PCR In situ Hybridisierung Paarung eines transgenen Tieres mit nicht-transgenem Tier: alle Nachkommen sind transgen -> Elterntier homozygot transgen; ca. 50% der Nachkommen sind transgen -> Elterntier heterozygot transgen
• Nachweis der Expression eines Transgens Expression des Transgens = erfolgreiche Erzeugung transgener Tiere Häufig gewebsspezifische und regulierbare Genexpression erwünscht Aber natürliche Expression des Transgens oft spät, nur in einem Geschlecht, nur wenn homozygot, nicht nachweisbar bei knockout daher Nachweis der Transgen-Expression über Nachweis der mRNA oder des Proteins mRNA-Hybridisierung RT-PCR Proteinanalysen Physiologische/anatomische Untersuchungen
• Gentransfer: Ziele bei Nutztieren Modellorganismen für Forschung Erstellung von Geweben/Organen für Xenotransplantation Erzeugung humanmedizinischer Pharmazeutika (Gene Pharming) und neuartiger Nahrungsmittel (Nutraceuticals) klassische "landwirtschaftliche" Ziele:Veränderung der Eigenschaften tierischer ProdukteVerbesserung der FutterverwertungSteigerung der ProduktivitätVerminderung der KrankheitsanfälligkeitVerminderung negativer Umwelteinflüsse der Tierproduktion

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