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Molekulare Tierzucht (Fach) / Gene- and Genome-Editing (Lektion)

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• Gene-Editing Gene- oder Genome-Editing umfasst als Oberbegriff das Repertoire molekularbiologischer Methoden zur zielgerichteten Veränderung des Erbutes (DNA) von (lebenden) Zellen und Organismen zielgerichtete Veränderung der DNA an einer spezifischen Zielsequenzstelle mithilfe von designten Enzymen relativ junge Methodengruppe mit dynamischer Entwicklung mittlerweile breit nutzbar durch kommerzielle Angebote "Zukunft" der gentechnischen Methoden
• Gene-Editing - Grundlagen, Prinzip und Anwendung spezifisch designte Endonuklease-Komplexe schneiden doppelsträngige DNA an einer vordefinierten, gewünschten Zielsequenz Doppelstrangbrüche die zu DNA.Reperatur-Prozessen in der Zelle führen, die im Rahmen von Gene-Editing Methoden gezielt genutzt werden können bspw. um eine Punktmutation zu korrigieren; Inaktivierung/Zerstörung eines Gens (Knock-Out); Einführung eines Gens an einer spezifischen Stelle im Genom (Knock-In)
• Endonukleasen- Grundlagen Endonukleasen sind wichtige Enzyme im Nukleinsäurestoffwechsel Spalung eines Stubstrates (DNA/RNA) durch Trennung einer inneren Phosphordiesterbindung in zwei Fragmente -> endonukleolytischer Verdau Sequenzspezifische Spaltung Bekannteste Anwendung bisher : Restriktionsenzyme Weiterentwicklung für Gene-Editing-Methoden durch Designer-Endonukleasen
• Reperatur-Mechanismen NHEJ: -> Non-homologous end-joining; schnelles Zusammenfügen zweier DNA-Fragmente nach einem DNA-Doppelstrangbruch ohne genaue Fehlerkorerktur; Beteiligt sind KU-Proteine die die Enden der Doppelstrangbrüche erkennen und markieren; DNA-Proteinkinasen und Kinasen-Komplexe verbinden die markierten Enden wieder miteinander; Fehlerbehaftet -> es entstehen Punktmutationen, kleine Deletionen, Insertionen HDR: -> homology directed repair: Reperatur von Brüchen in homologen, doppelsträngigen DNA-Molekülen; Als Vorlage für die Reperatur dient der homologe Strang des unbeschädigten Schwesterchromosoms; Genauer Abgleich, Sequenzfehlerkorrektur, aber Austausch zwischen den homologen Chromosomen möglich -> Rekombination
• Design-Endonukleasen natürliche Endonukleasen schneiden die DNA zwar an der spezifischen Stelle, aber nicht so spezifisch, das eine zielgerichtete Anwendung alleine möglich ist Eine zielgerichtete Anwendung wird erst durch eine Kombination mit möglichst individuell designbaren DNA-Erkennungsdomänen /-sequenzen möglich Beispiele für in der Biotechnolgie / Gene-Editing genutzte Endonukleasensystem: Zinkfingernukleasen TALENs Cas9
• TALENs Transcription activator-like effector nuklease (transkriptionsaktivatorartige Effektornuklease) künstliche sequenzspezifische Restriktionsenzymkomplexe synthetische Fusionsproteine aus: TAL effector-DNA-Bindenen-Domäne ANWENDUNG: Identifikation einer Targe-Sequenz im Genom des Zielorganismus die verändert/ modifiziert werden soll Konstruktion eines Designer-Gens, das für eine für die Target-Sequenz spezifische TALEN codiert und diese exprimieren kann Replikation, Amplifikation und Integration dieses Design-Gens in einen Plasmid im Labor  Einschleusen des Plasmids in eine Zielzelle und Exprimierung des TALEN-Gens in der Zielzelle Akitv exprimierte TALENs in der Zielzelle, schneiden die in der Zielzelle enthaltene DNA an der Targetsequenz und aktivieren Reperaturprozesse

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