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Molekulare Tierzucht (Fach) / Grundlagen (Lektion)

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• Genom/ Chromosomen Genom = Gesamtheit der chromosomalen DNA einfacher/ haploider Chromosomensatz Säugetier = ca. 3x109 bp homologe Chromosomen → diploider Chromosomensatz Jedes Chromosom enthält einen ununterbrochenen DNA-Faden Chromosomen enthalten Erbanlagen (Gene, Marker) Chromosom = Transport- und Verpackungseinheit der DNA
• Mitochondriale DNA (mt DNA) Mitochondrien: Innere und äußere Membran; Hauptaufgabe: Oxidative Phosphorylierung (Atmungskette); "Kraftwerke der Zelle" → eigene genetische Information: mt DNA; Endosymbiontentheorie ringförmig Größe ca. 16000 bp Information für ca. 20 Proteine (v.a. Enzyme der Atmungskette) Komplementäre Stränge: H- und L-Strang (meisten Gene auf H-Strang) D-Loop (Kontrollregion): Ursprung der Replikation; hoch variabel
• Vererbung von mtDNA Spermienzellen: ca. 500 Mitochondrien Eizellen: ca. 500 000 Mitochondrien Bei Befruchtung: Proteolytischer Abbau der Spermien- Mitochondrien → Weitergabe der mtDNA nur über weibliche Linie → maternale Vererbung → sehr gut geeignet für z.B. phylogenetische Untersuchungen
• Aufbau der RNA Ribose als Zuckermolekül Uracil statt Thymin fast immer einzelsträngig, aber Neigung zur Bildung von Sekundärstrukturen
• Wichtige RNA-Arten mRNA (messenger RNA) tRNA (tranfer RNA) rRNA (ribosomale RNA) = 80% der RNA-Moleküle miRNA (microRNA), siRNA (small interfering RNA)
• Gen Funktionseinheit der DNA, in der die kodierenden wie auch die regulatorischen Sequenzen für ein Protein, eine rRNA oder eine tRNA lokalisiert sind.
• DNA - Varianten SNP (single nucleotide polymorphism) Nukleotid -substitution (Transition oder Transversion), -deletion, -insertion VNTR (variable number of tandem repeats (z.B. Mikrosatelliten)
• Nutzung genetischer Polymorphismen in der Tierzucht Abstammungs- und Identitätskontrollen Kartierung von Genen QTL- Analysen, Assoziationsanalysen Entwicklung von direkten und indirekten Gentests Diversitäts und Evolutionsstudien Untersuchung und Beeinflussung von Genfunktionen
• DNA-Extraktion: Arbeitsschritte 1.Aufbrechen der Zellen und Zellkerne osmotisch, chemisch, enzymatisch Detergenzien, z.B. Natrium-Dodecylsulfat (SDS), Proteinase K 2.Entfernung der Proteine Dichtegradientenzentrifugation; organische/ an-organische Lösungsmittel; Denaturierung und Ausfällung 3. Ausfällung (Präzipitation) oder Eluierung der DNA Zusatz von Alkohol oder Elutionslösung
• Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zyklische Vervielfältigung (Amplifikation) von DNA-Molekülen in vitro durch Einsatz der DNA-Polymerase und verschiedener Temperaturen Reaktion mit : Denaturierung der DNA-Doppelstränge (ca.95°C); Annealing (Anlagerung) der Primer (ca.55°C), Extension/Elongation (Verlängerung) der DNA (72°C) "Zutaten": Template = Ausgangs-DNA Primer Nukleotide Puffer Thermocycler
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• Elektrophorese von NS Ziel: Darstellung der Größe- bzw. des Molekulargewichts; der Konformation; der Menge (Quantifizierung); der Reinheit und der Qualität einer Nukleinsäure Prinzip: Nukleinsäuren sind negativ geladen → wandern zum +Pol (Anode) keine geladenen Seitenketten (≠ "Molekularsiebe") Trennung von unterschiedlichen NS-Molekülen im elektrischen Feld nach Unterschieden in der Größe →Gelmatrix: Agarose, Polyacrylamid; und der Konformation →Gelmatrix: Polyacrylamid
• Single-Strand-Conformation-Polymorphism (SSCP) Prinzip: Nachweis von Variationen innerhalb eines DNA-Fragmens (i.d.R. PCR-Produkt -> PCR-SSCP) durch sequenzabhängige Veränderung der Konformation von DNA-Einzelsträngen Nachweis durch native PAGE -> Darstellung unterschiedlicher Konformationen
• Restrktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) Prinzip: Nachweis von Variationen innerhalb eines DNA-Fragments durch Veränderung einer Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym Nachweis durch Enstehung oder Verschwinden einer Restriktions-Schnittstelle
• Restriktionsenzyme: Endonukleasen aus Bakterien / rekombinant RE-Namen: Gattung, Art und Stamm des Bakteriums erkennen Zielsequenz in der DNA, z.B. GATC z.B. 4-, 6-, 8-cutter drei Kategorien (Typ I bis III)
• Restriktionsenzym-Typen Typ I: erkennt spezifische DNA-Sequenzen, schneidet aber zufällig und außerhalb dieser Sequenz → :-( Typ III: erkennt spezifische DNA-Sequenzen , schneidet 20-25 bp entfernt vom Motiv → :-| Typ II: erkennt spezifische DNA-Sequenzen und schneidet in oder an diesem Motiv → :-)
• Fragmentanalyse: Nachweis von repetitiven Sequenzen VNTR = Variable Numbers of Tandem Repeats Minisatelliten (Repeatmotive ≥10 bp) Mikrosatelliten (Repeatmotive < 10 bp, meist 1-4 bp); Wiederholung der Repeateinheit meist 5-10 x ; Gleichmäßige Verteilung im Genom, meist  in nicht-codierenden Bereichen)
• Mikrosatelliten (MS) MS sind gleichmäßig im Genom verteilt v.a. in nicht- transkribierten Bereichen des Genoms
• Nutzungsmöglichkeiten von DNA-Varianten für molekulare Gendiagnostik Nachweis von: Erbfehlern züchterisch vorteilhaften oder nachteiligen Genvarianten Identität, Abstammung, Rasse, Diversität etc. Merkmale müssen nicht phänotypisch sichtbar sein: Nachweis unabhängig von Geschlecht, Alter (Embryonen), Merkmalserfassung, Umwelteinflüssen auch bei rezessiven Merkmalen Nachweis von Anlageträgern möglich
• Direkte und indirekte Gentests direkter Gentest: kausale DNA-Variante bekannt (i.d.R. SNP oder Indel) evtl. kausaler Gen-Locus bekannt Indirekter Gentest: Kausale DNA-Variante ist nicht bekannt Genotypisierung von Marker-Loci in der Nachbarschaft des kausalen Gen-Locus (Mikrosatelliten, SNPs)
• Beispiel: Gentest für BLAD Bovine Leukozyten-Adhäsions-Defizienz (BLAD) autosomal rezessiv Punktmutation im CD I 8-Gen: Asp → Gly ->CDI8-Adhäsionsmolekül defekt -> gestörte Funktion der Leukozyten -> Immundefekt -> Kälber sterben im 1. Lebensjahr Gentest: direkter Gentest, z.B. als PCR-RFLP-Analyse
• DNA-Sequenzierung Kettenabbruchverfahren nach Sanger = Standardmethode Prinzip: Einbau von ddNTPs (Terminator) führt zum Kettenabbruch dNTP: ddNTP = 200 : 1 --> statistisch findet mindestens 1x hinter jedem Nukleotid ein Kettenabbruch statt ddNTP: Didesoxy-Nucleosid-Triphosphat: 3' Hydroxylgruppe fehlt an der Pentose -> Nachfolgende dNTPs können nicht mehr angehängt werden
• Sequenzierreaktion Zusammensetzung und Reaktion: Template: PCR-Produkt (oder Plasmid) 1 Sequenzierprimer (häufig einer der beiden PCR-Primer) dNTPs ddNTPs Polymerase Puffer Sequenzierreaktion wie PCR: Denaturierung, Annealing, Elongation
• Markierungstechniken dye primer chemistry: Markierung des Startprimers dye terminator chemistry: Markierung der ddNTPs
• DNA - Arrays schnelle und gleichzeitige Analyse mit geringen Substanzmengen genutzt für: Identifizierung von DNA-Varianten (SNPs) -> SNP-Chip und Messung der Expression versch. Gene -> Transkriptionsaray Viele einzelne Felder (100-1Mio) auf einem Träger (=Array, Chip) Pro Feld viele gleichartige DNA-Moleküle bekannter Sequenz als Sonde an Träger fixiert basiert auf Hybridisierung freier Fluorochrom-markierter Target-DNA (die man untersuchen will) mit Sonden-DNA
• Hybridisierung von Target und Sonde Prinzipieller Vorgang: Prähybridisierung des Trägers mit Puffer zur Blockade unspezifischer DNA-Bindung Zugabe des Targets im Hybridisierungspuffer Inkubation bei bestimmter Temperatur (ca. 25°C unter Schmelztemperatur der DNA-Doppelhelix) Waschen mit Puffer --> nur hybridisierte DNA bleibt auf Träger --> führt dazu, dass die markierten Targetmoleküle in solchen Testfeldern immobilisiert werden, in denen die Sonde über komplementäre Sequenzen verfügt Signale werden in jedem einzelnen Feld des Arrays gemessen

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