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sekundäre inhaltsstoffe (Fach) / 10. Analytik sekundärer Inhaltsstoffe (Polyphenol) (Lektion)
Uni Bonn WS'17/'18
Diese Lektion wurde von melxying erstellt.
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- Qualitative Analyse von Polyphenol. Oxidation von Polyphenol: ⇒ zu hoheren Polymeren mit brauner Farbe. 1. Enzymatische Oxidation (Mostoxidation) a) Enzym: Polyphenoloxidase (PPO) – das Homolog der Tyrosinase in Pflanzen → Verantwortlich für die Bräunung von Pflanzenmaterial nach Verletzung & Kontakt mit O2)– Kalibriert mit Tyrosinase– Enzymaktivität bei 405 nm ermittelt PPO2x o-Di-phenol ——→ 2x o-Quinone O2 → 2 H2O b) Enzyme: Peroxidase (POD)– Kalibriert mit Guajakol-peroxidase (Meerrettich) – Enzymaktivität bei 405 nm ermittel POD2x o-Diphenol ——→ 2x Semiquinone —Dismutation→ o-Quinone + Catechol H2O2 → 2 H2O 2. Gesamtphenolgehalt: (Folin Ciocalteu Methode) Folin Ciocalteu Reagenz Kolorimetrische Bestimmung = Konz.-bestimmung durch eine Vergleichs-messung mit einer Farbskala, die einer bekannten Konz. der Substanz entspricht. Kalibriert mit Gallussäure Absorption gemessen bei 720 nm
- Simultanbestimmung von Polyphenolen in Gemüse, Obst & Tee:: Probenvorbereitung (Durchführung), Simultanbestimmung von Polyphenolen in Gemüse, Obst & Tee: 1. Probenvorbereitung: Extraktionstechniken:a) Liquid-Liquid Extraktion (LLE)b) Solid-Liquid Extraktion (SLE)⇒ beide entw. Ultraschall od. Mikrowellenunterstütztc) SFE (Supercritical Fluid Extraction) mit CO2 + MeOH od. EtOH Aufkonzentration/Reinigunga) RP-SPE (Solid Phase Extraction)b) Mixed Mode Ion exchange/ RP-SPE Durchführung der Probenvorbereitung: – Häckseln & Malen im Homogenisator in flüssigem N2 für Obst & Gemüse– Tee gemahlen in Kaffeemühle↓ Gefriertrocknung (0,2 Pa; 48h)↓ 50 mg Probe + IS (50 mmol Flavon in DMSO(Dimethylsulfoxid)↓ SLE mit 2 mL 90% MeOH/Wasser (+0,5 AcOH) 1 min im Ultraschallbad↓ Abzentrifugieren↓ Erneute Extraktion des Rückstandens (2x Wdh. ab 4.)↓ Trocknen im Zentrifugalverdampfer↓ Elution in 0,5 mL DMSO↓ Filtern über 0,2 μm Membranfilter
- Simultanbestimmung von Polyphenolen in Gemüse, Obst & Tee: Instrument & Kalibrierung Simultanbestimmung von Polyphenolen in Gemüse, Obst & Tee: Instrument: Chromatographien: TLC (Thin Layer chromatography) RP(reversed phases)-HPLC, Ultra-HPLC Derivativ-GC LCxLC (Two-dimensional Liquid Chromatography), HSCCC (High-Speed Countercurrent Chromatography), SFC (Supercritical Fluid Chromatography), CE (Capillary Electrophoresis) Detektion: Dioden Aray Detektor Q-MS (Quadrupol-Massenspektrometer), QqQ(Triple-Quadrupol)-MS , TOF(Time-of-flight mass spectrometer) , qTOF Kalibrierung: Anlegen einer Bibliothek zur Identifizierung nach Retentionszeit & DAD(Diodenarray-Detektor)-Spektrum mit 100 Standardsubstanzen Kalibration bei stoffgruppenspezifischen Wellenlängen
- Warum wird ein Vakuum bei Massenspektrometrie benötigt? Massenspektrometrie muss immer im Hochvakuum stattfinden. 1. Bei zu hohem Druck würden die Ionen durch Zusammenstöße mit Luftmolekülen gestreut, von ihrem Weg abgelenkt & könnten so den Detektor nicht erreichen. 2. Ermöglicht der Produktion von freien Ionen & Elektronen in der Gasphase
- Aufbau eines Massenspektrometer-Apparats: Aufbau eines Massenspektrometer-Apparats: Einlassystem → Ionenquelle → Massenanalysator→ Detektor→ Datensystem 1. Einlassystem: i) Direkteseinlass ii) Indirekter Einlass iii) Gaschromatograph 2. Ionenquelle: (Unter Vakuum) – Analyt wird ionisiert– die entstandende Ionen werden mit einem elektrischen Feld aus der Ionenquelle beschleunigt & in den Analysator übergeben. Elektronenstoß-Ionisation Chemische Ionisation Fast Atom Bombardement Feldionisation/ -desorption 3. Massenanalysator: (Unter Vakuum) – Hier werden die Ionen getrennt & dann vom Detektor registriert (Magnetfeld & Elektrisches Feld) – Masse/Ladungsverhältnis der Ionen ist entscheidend für die Trennung. – Trennung der Ionen beruht auf ver. physikalischen Prinzipien: a) Ablenkung von Ionenstrahlen in elektrischen od. magnetischen Feldern b) Filterung von Ionen unterschiedlicher Masse in elektrischen Wechselfeldern (Massenfilter z. B. Quadrupol, MS/MS) c) auf den unterschiedlichen Flugzeiten von Ionen im feldfreien Raum. 4. Detektor: (Unter Vakuum) – Intensität des Ionenstroms wird ermittelt. – Messung: a) Ortsabhängig (Ablenkung der Ionen von Laufbahn mit unterschiedlichen Radius) b) Zeitabhängig
- Was versteht man unter Quadrupole Massenfilter Quadrupole Massenfilter im Massenspetrometer eingesetzt Im Quadrupol können sich die Ionen bestimmter Masse/Ladungsverhältnisse je nach Stärke der anliegenden elektrischen Felder auf stabilen od. instabilen Flugbahnen bewegen. Durch Variation dieser Parameter werden Ionen verschiedener Masse nacheinander auf stabile Flugbahnen gebracht & damit durch den Quadrupol gelassen. → Sie werden also gefiltert - man spricht von Massenfiltern.
- MS/MS (Tandem-Massenspektrometrie) https://de.wikipedia.org/wiki/Massenspektrometrie#/media/File:MS_MS.svg MS/MS (Tandem-Massenspektrometrie) Um Fragmentierungen zu studieren od. Um die Selektivität & Sensitivität (Nachweisgrenze) einer Quantifizierungs-methode zu verbessern⇒ koppelt man mehrere Analysatoren hintereinander od. arbeitet in Ionenfallen. Kombinationen der Analysatoren: z. B. Triple-Quadrupol (QqQ) Q 1 : Im ersten Quadrupol wird dabei eine Quasi-Molekül-ion durch ESI (Elektrospray-Ionisation) produziert & isoliert dann.. Q 2 : Im zweiten Quadrupol (Kollisionszelle od. Stoßkammer) wird das Quasi-Molekülion angeregt. Q 3 : Der dritte Quadrupol gibt die Möglichkeit zu „scannen“: – alle Produktionen des Ions zu ermitteln, od. – selektiv nur ein bekanntes Fragmention zu beobachten.⇒ Erfassen aller Fragment-ionen können Rückschlüsse auf die Struktur gezogen werden.
- Was versteht man unter ätherische Öle? Wo wird sie in Pflanzen synthetisiert Ätherische Öle sind komplexe Gemische lipophiler Stoffe, die aus den verschiedensten Pflanzenteilen durch Destillation od. Pressung (Citrus) gewonnen werden. Wegen der Flüchtigkeit reizen ätherische Öle den Geruchssinn Ort der Synthese: in Zellen mit besonders intensiver Stoffwechseltätigkeit & auffälligem Plastidenreichtum des Cytoplasmas ätherische Öle, die Zellgifte sind, werden dann in besonderen Räumen gespeichert; liegen an der Ölbildungsstätte & gewährleisten Abschirmung vom umgebenden Gewebe Ölbehälter der Blätter bereits im Knospenstadium vorgebildet
- Wie wird das Vorkommen eines ätherischen Öls nachgewiesen? Identifizierung von ätherischen Öle: Gaschromatographie (GC) Massenspektrometrie (MS)
- Wie werden best. ätherische Öle identifiziert? Identitätsprüfung: Typische Bestandteile von ätherischen Ölen, die zur Prüfung der Identität dienen: Anisöl: Anethol, Anisaldehyd, Linalool Citronenöl: Bergamotin, Biakangelicin, Citral, Citropen, 5- Geranyloxy-7methoxycumaren Eucalyptusöl: Cineol Fenchelöl: Anethol, Anisaldehyd, Fenchon Kümmelöl: Carvon Lavendelöl: Linalool, Linalylacetat, Caryophyllenepoxid
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- Anwendung Ätherischöldrogen Anwendung: Durchspülung bei entzündlichen Erkrankungen d. Harnwege Therapie bei Nierengries Verdauungsbeschwerden Schleimlösung b. Katarrhen der Luftwege
- Sie wollen einen Hustenmittel zusammenstellen. Was müssen Sie erst betrachten? Optionen? 1.Bei der Zusammenstellung der üblichen Hustenmittel rechnet man mit dem Auftreten aller Begleiterscheinungen des Hustens: Zäher Auswurf Trockenheit im Rachenraum Krampferscheinungen Infektionen (seltener) 2. Also ein Hustenmittels muss:...wirken. reizlindernd sekretlösend sekretions- und auswurffördernd spasmolytisch antibakteriell 3. Optionen: Hustensäften: z. B. Zuckersirup & Honig→ auf osmotischem Weg körpereigenes Sekret erzeugt Saponine:– bewirken durch Magenschleimhautreizung eine reflektorische Vaguserregung, die zur Steigerung der Bronchialsekretion führt. → Sekret wirkt einhüllend wie die exogenen Schleimstoffe, trägt zum Schutz d. entzündeten Schleimhäute bei. Ätherische Öle:– im Gegensatz zu Saponinen, vom Magen-Darmtrakt und durch die Haut resorbiert.– Teilweise durch die Lunge ausgeschieden und gelangen demgemäß in tiefere Bronchialabschnitte; → Oberflächenaktivität führt zur Verflüssigung des Bronchialschleims ⇒ Zum Einreiben & Inhalieren wird verwendet (Gemische): • Campher • Eucalyptusöl • Kiefernadelöl • Menthol • gereinigtem Terpentinöl
- Was versteht man unter ätherische Öle? Ätherische Öle: Leicht flüchtige & entzündbare Stoffgemische Bestehen aus größtenteils aus Gemischen vers. Terpene, Sesquiterpene od. aromatischer Verbindungen (organischen Stoffen) Die Terpene sind Hauptbestandteil der Öl häufig in Öldrüsen in den Blättern von Pflanzen produziert & im Pflanzen-Gewebe gespeichert.
- Erklären Sie das Prinzip der GC & zeichnen Sie den GC-Aufbau. Gaschromatographie (GC): als Analysenmethode zur Auftrennung eines Stoffgemisches durch unterschiedliche Verteilung seiner Einzelbestandteile zwischen einer stationären & einer mobilen Phase. NUR anwendbar für Komponenten, die gasförmig od. unzersetzt verdampfbar sind (Siedebereich bis 400 °C) 1. Prinzip: Mittels apolaren Phasen werden apolare Analyt-moleküle gemäß ihren Siedepunkten getrennt. Flüchtigere Substanzen (mit niedrigem Siedepunkt) befinden sich zum Großteil in der mobilen (Gas)Phase & werden deshalb schnell durch die Säule transportiert.d. h. Je geringer der Siedepunkt, umso kürzer ist also die Retentionszeit. 2. Aufbau & Durchführung: Zunächst injiziert man das zu trennende Gemisch mit einer Dosiernadel in den Einspritzblock. Darin wird das Gemisch erhitzt & verdampft. Das Trägergas wird aus einer Gasdruckflasche in die Einspritzkammer geleitet, reißt das dampfförmige Gemisch mit & gelangt in die Trennsäule.– Als mobile Phase wird ein Inertgas (Stickstoff od. Helium) verwendet.– Trennsäule ist innen mit einer definierten stationären Phase ausgekleidet & befindet sich in einem temperierbaren Ofen. Einzelne Komponenten des Gemisches lösen sich entsprechend ihrer physikalischen Eigenschaften in der stationären Phase & werden von dieser entsprechend stark zurückgehalten. Nach Verlassen der Trennsäule strömt das Trägergas über einen Detektor. Der Detektor erzeugt ein elektrisches Signal beim Durchströmen der einzelnen Stoffe. Dieses Signal wird verstärkt, in ein Spannungssignal umgewandelt & in einem Gaschromatogramm aufgezeichnet. Heute übliche Gaschromatographen (GC) haben einen Massespektrographen (MS) angeschlossen => GC-MS-Kopplung => sofort auf die Massen & auf den Aufbau der Moleküle schließen. https://bitesizebio.s3.amazonaws.com/wp-content/uploads/2016/04/28144332/Figure-1_BSB_FirstArticle.png
- Was versteht man unter MS? Massenspektrometrie = Verfahren zum Messen der Masse von Atomen od. Molekülen. Eingesetzt wird sie bei der Charakterisierung & Identifizierung von chemischen Verbindungen. Die zu untersuchende Substanz (der Analyt) wird in die Gasphase überführt & ionisiert. Die Ionen werden durch ein elektrisches Feld beschleunigt in dem Analysator zugeführt, Im Anaylsator werden die Ionen nach dem Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) „sortiert“ & räumlich in Teilstrahlen aufgetrennt.
- Erklären sie die grafische Darstellung eines Massenspektrums Grafischer Darstellung eines Massenspektrums Y-Achse = Relative Intensität, (I) in % Masse/ Ladungsverhältnis (m/z) Interpretation: Molekül-ionen-peak = das Signal bei der höchsten Masse. ⇒ Molekulargewicht der Probe kann direkt daraus entnommen werden. Basispeak = das Signal mit der höchsten Intensität. ⇒ Darauf bezieht man sich bei der Berechnung der relativen Intensitäten aller anderen Peaks. Fragment-ionen-peak = Alle Signale im Massenspektrum, deren Masse kleiner als die des Molekülions ist. ⇒ liefern Aussagen über die Struktur des Analyts.
- Quantitative Analyse des antioxidativen Potentials der Polyphenole Antioxidatives Potential der Polyphenole mit ABTS (= Redoxindikator) Das aus ABTS gebildete Radikal ist photometrisch leicht detektierbar. Deshalb wird als Substrat für Enzyme verwendet, das am Metabolismus der freien Radikale beteiligt sind. ABTS bildet in oxidativem wässrigen Milieu (Reaktion mit H2O2) ein stabiles, grün gefärbtes Radikal-kation, das bei 405 nm photometrisch gemessen werden kann. ⇒ Je heller des Endprodukt, desto höher ist die Antioxidantien Aktivität.