Typische Ansatzpunkte für die Regulation ganzer Stoffwechselwege sind Enzyme, die praktisch irreversible Reaktionen katalysieren. Bei der Glykolyse ist die Phosphofructokinase das Schlüsselenzym und somit wichtigster Ansatzpunkt zur Kontrolle der Glykolyse.

ATP ist ein allosterischer Inhibitor der PFK und AMP/ADP sind allosterische Aktivatoren. Die Glykolyse wird also u.a. von der Energieladung der Zelle kontrolliert. Ist die Energieladung hoch (=viel ATP vorhanden, wenig AMP/ADP), dann wird die PFK inhibiert und die Glykolyse somit herunter reguliert. Ist die Energieladung gering (=viel AMP/ADP, wenig ATP), wird die PFK aktiviert und die Glykolyse hoch reguliert.

Auch Citrat kontrolliert die Aktivität der PFK: viel Citrat hemmt die PFK, es wird weniger Pyruvat gebildet.

Die Glykolyse kann indirekt auch über die Hexokinase kontrolliert werden. Die Hexokinase wird über ihr eigenes Produkt Glucose-6-phosphat gehemmt. Man spricht von einer Produkthemmung. Normalerweise wird G-6-P schnell weiter verstoffwechselt. Ist allerdings die PFK blockiert, kommt es zu einem Rückstau und somit zu einer Hemmung der Hexokinase.

Die Glykolyse kann auch über die Pyruvat-Kinase kontrolliert werden. Fructosen-1,6-bisphosphat ist eine allosterischer Aktivator. ATP, Acetyl-CoA und Alanin sind allosterische Inhibitoren.