Die Spaltungsregel oder Segregationsregel gilt, wenn zwei Individuen gekreuzt werden, die beide gleichartig heterozygot sind, also z. B. zwei Pflanzen, die für die Blütenfarbe beide die beiden Erbanlagen „weiß“ und „rot“ haben. Das kann etwa die F₁-Generation des vorherigen Abschnitts sein. In Beschreibungen der mendelschen Regeln werden die Nachkommen einer solchen Heterozygoten-Kreuzung daher als Enkel- oder zweite Filialgeneration (F₂) bezeichnet. Die Nachkommen aus dieser Paarung sind untereinander nicht mehr uniform, sondern spalten sich sowohl im Genotyp als auch im Phänotyp auf.

• Handelt es sich um eine dominant-rezessive Vererbung, so sind durchschnittlich ein Viertel der F₂-Individuen reinerbig mit zwei rezessiven Erbanlagen und zeigen eine entsprechende Merkmalsausprägung (z. B. weiße Erbsenblüten). Die anderen drei Viertel zeigen im dominant-rezessiven Erbgang den Phänotyp der dominanten Erbanlage. Diese drei Viertel setzen sich zusammen aus reinerbigen (ein Viertel) und mischerbigen (zwei Viertel) Individuen. Insgesamt besteht also im Phänotyp ein Verhältnis von 3:1, im Genotyp eines von 1:2:1.

Bei intermediärer Vererbung weist je ein Viertel der Nachkommen eine der beiden reinerbigen Varianten und die Hälfte der Individuen die Mischform der 1. Generation auf (Verhältnis von 1:2:1, da der Genotyp am Phänotyp erkennbar bleibt).

Bei kodominanter Vererbung gilt die Aufspaltung im Verhältnis 1:2:1 analog.